光學(xué)顯微鏡zui重要的部件物鏡的特性介紹

今天和大家談?wù)劰鈱W(xué)顯微鏡當(dāng)中zui重要的部件：物鏡。為什么是zui重要且沒(méi)有之一呢？因?yàn)榭蒲泄ぷ髡邆冴P(guān)心的解析度、信噪比等與成像質(zhì)量息息相關(guān)的參數(shù)都是由物鏡決定的。當(dāng)然，顯微鏡的其他部分也一樣*，但是篇幅有限，即便是物鏡，我們也只能淺嘗輒止的談一談。

 在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，光學(xué)顯微鏡的使用率位列儀器的，如果有人不相信，那請(qǐng)看看周圍吧，不管是在實(shí)驗(yàn)室，還是在醫(yī)院，我們都隨處可見(jiàn)顯微鏡們靚麗的身影。

而隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，在光學(xué)顯微鏡的基礎(chǔ)上，衍生出許多其他復(fù)雜的成像系統(tǒng)。例如全內(nèi)反射熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡、多光子激光掃描顯微鏡等等。絕大多數(shù)的科研工作者們，都需要或多或少的和顯微鏡大家族中的成員們打交道。這個(gè)時(shí)候，對(duì)這些復(fù)雜系統(tǒng)的了解就有一些迫切了。

那么作為物鏡當(dāng)中，zui不可不談的東西就是物鏡的zui重要的參數(shù)：數(shù)值孔徑。

數(shù)值孔徑即Numerical Aperture  所以在中國(guó)我們通常稱之為NA值，NA值的大小直接標(biāo)注在物鏡上，大家平時(shí)切換物鏡的時(shí)候，有觀察過(guò)嗎？通常來(lái)說(shuō)NA值越大，物鏡的成像質(zhì)量越好。為什么會(huì)這么說(shuō)呢？我們先來(lái)看看數(shù)值孔徑的計(jì)算公式：
NA = n (sin µ)
其中n是物鏡與樣本之間介質(zhì)的折射系數(shù)，µ是物鏡孔徑角的一半。

作為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究者，我們不必去深究為什么NA的公式是如上所示，但是，我們需要了解的是為什么NA值是物鏡zui重要的參數(shù)，所以趁熱打鐵，我們?cè)倏纯聪旅鎯蓚€(gè)公式：
R= 1.22λ / [NAObj + NACon]
R = 1.22 • λ/(2 • NA)
上面兩個(gè)公式的左邊R，決定了物鏡的分辨率，即物鏡可以區(qū)分兩點(diǎn)間的zui短距離。接著我們?cè)倏纯垂降挠疫叄?lambda;是入射光的波長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)條件恒定的情況下，跟數(shù)值一樣都是定制，而我們看到NA都是處在分母的位置上，即NA值越大，R的數(shù)值就越小，分辨率就越高，所以我們觀察樣本的解析度就越高，通俗點(diǎn)來(lái)說(shuō)，就是可放大的倍率越大。那么為什么會(huì)兩個(gè)公式呢？因?yàn)?個(gè)是透射光的計(jì)算公式，另一個(gè)是反射光的。順帶一提的是，通常來(lái)說(shuō)NACon即聚光鏡的數(shù)值孔徑要小于高倍物鏡的數(shù)值孔徑，所以熒光成像的分辨率要高于明場(chǎng)成像。

談到反射光，作為現(xiàn)如今zui重要的成像手段，熒光成像在顯微成像領(lǐng)域毋庸置疑的處在壟斷地位，這里筆者不得不多談一下她，因此為大家介紹如下公式：
Intensity ∝ (NAobj)4/Mag2
在這個(gè)公式中Intensity的大小指的是熒光的強(qiáng)度值，而NA值這一次出現(xiàn)在了分子的位置，所以NA值越大，熒光強(qiáng)度越大，所以得到的熒光圖像信噪比越高，圖片質(zhì)量越好。如果是進(jìn)行時(shí)間序列成像，高NA值的物鏡，還能大大減少曝光時(shí)間，提高成像速度，從而更好的捕捉快速移動(dòng)的熒光標(biāo)記物。

 綜上所述，雖然較為粗略和淺顯，但是我們依然可以大致了解NA值的重要性，同時(shí)也對(duì)物鏡也有了初步的了解，那么隨之而來(lái)的問(wèn)題就出現(xiàn)了：

NA既然如此重要，為什么物鏡種類卻如此千差萬(wàn)別 ？

既然NA值如此重要，顯微鏡廠商們都只生產(chǎn)高數(shù)值孔徑的物鏡不就好了？為什么還要生產(chǎn)那么多種類繁多的物鏡呢？我們?cè)倩剡^(guò)來(lái)看看NA的計(jì)算公式：
NA = n (sin µ)
NA的大小跟介質(zhì)的折射率有著直接的關(guān)系，如果各位生命科學(xué)研究者高中數(shù)學(xué)還沒(méi)有忘干凈的話，應(yīng)該知道sinzui大值只有1，所以介質(zhì)折射率越大，物鏡的NA值越大，這也是為什么我們高倍顯微鏡是油鏡的原因。

答案也就隨之而來(lái)，很顯然，如果樣本不能接觸，或是加入其他介質(zhì)，我們就只能選擇空氣作為介質(zhì)，從而限制里物鏡的NA值大小。那么如果可接觸的話，是不是所有的樣本都用高折射率的介質(zhì)呢？下面我們?cè)賮?lái)看看下面要說(shuō)的概念。

深層成像：球差的困擾！

上面這組實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)折射率為1.38的樣本進(jìn)行了200um的成像，分別用了三種不同的介質(zhì)，分別是：水折射率為1.33；硅油折射率為1.40；油折射率為1.51。在樣本表面成像時(shí)，油介質(zhì)無(wú)愧其高NA值的強(qiáng)大特性，成像亮度是三種物鏡之中zui高的，但是當(dāng)觀察深度至200um的時(shí)候，油介質(zhì)的物鏡基本無(wú)法觀察到熒光型號(hào)，而在深層觀察時(shí)，成像質(zhì)量的是折射率為1.4的硅油物鏡。Why？細(xì)心的同學(xué)們應(yīng)該會(huì)發(fā)現(xiàn)，我們所用的樣本介質(zhì)為1.38，而硅油的折射率是zui接近樣本的，所以在深層成像的時(shí)候，介質(zhì)差所造成的球差就會(huì)被減到zui小。這種光學(xué)現(xiàn)象對(duì)于學(xué)生物的同學(xué)來(lái)說(shuō)可能較難理解，但是我們從左邊的示意圖可以看出來(lái)，當(dāng)介質(zhì)相近的時(shí)候，光路的焦點(diǎn)匯聚更加容易而不會(huì)產(chǎn)生在深層觀察時(shí)候光線分散的情況，從而能獲得較好的深層次的熒光信號(hào)。

由上面這組實(shí)驗(yàn)，我們可以得到很多有用的信息，好學(xué)的同學(xué)就會(huì)去查詢自己常用的樣本的折射率了吧？通常來(lái)說(shuō)細(xì)胞樣本的折射率在1.33~1.35，活體或者厚組織的折射率在1.36~1.38，因此，當(dāng)我們的實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行深層成像的時(shí)候，對(duì)于細(xì)胞樣本我們需要盡量選用水介質(zhì)的物鏡，而當(dāng)進(jìn)行厚組織樣本或者果蠅斑馬魚(yú)這樣的活體深層成像時(shí)，使用硅油介質(zhì)的物鏡得到的圖像質(zhì)量會(huì)更加出色。當(dāng)然，如果只是樣本表面成像，油鏡的成像質(zhì)量是的。

伴隨著深層成像的迫切需求，空間的共定位分析，也被各位研究者們廣泛使用，傳統(tǒng)的2D共定位分析得到的結(jié)果往往是錯(cuò)誤的不真實(shí)的。但是對(duì)于空間共定位來(lái)說(shuō)，我們不可避免的就又要考慮另一個(gè)重要的物鏡參數(shù)色差矯正。

空間共定位分析：不可不談的色差

色差是什么？色差又是如何產(chǎn)生的？上面的圖例中展示的就是色差的概念。通俗點(diǎn)來(lái)說(shuō)就是由于不同顏色的光波長(zhǎng)不一樣，所以當(dāng)她們通過(guò)光學(xué)部件的速度也不一樣，因此產(chǎn)生了一個(gè)光斑在成像的時(shí)候顏色分散開(kāi)的情況產(chǎn)生，這就是色差。

對(duì)于顯微鏡廠商的物鏡系列，對(duì)于綠色紅色的矯正都相當(dāng)?shù)某錾?，但是，絕大多數(shù)廠家對(duì)于近紫外的矯正都不盡如人意。這一點(diǎn)瑕疵在進(jìn)行空間核定位的時(shí)候，就會(huì)出現(xiàn)很嚴(yán)重的問(wèn)題，在獲得成像結(jié)果之后，我們很難確定我們的熒光標(biāo)記物與核的關(guān)系是真實(shí)的，還是由于色差造成的。

對(duì)此，各家廠商都有相對(duì)應(yīng)的手段，但是只有OLYMPUS在物鏡上下了功夫，推出了一款號(hào)稱SC（超級(jí)色差矯正）的60倍物鏡，恰巧筆者手上真好有這枚物鏡，便做了如下測(cè)試。

上組實(shí)驗(yàn)圖片用自發(fā)熒光小球作為樣本，用不同激發(fā)光成像，之后做了3D重構(gòu)。從圖片中我們可以看出，即便是OLYMPUS顯微鏡的物鏡近紫外的色差依然有0.5um左右的偏差，而SC物鏡的兩種顏色基本切合，誤差要小于0.1um，基本上在核定位上就可以得到比較真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果了。

雙光子物鏡：顛覆性的物鏡設(shè)計(jì)理念

說(shuō)了這么多概念性的東西，其實(shí)僅僅只是管中窺豹，顯微鏡系統(tǒng)要更加復(fù)雜的多，在zui后的篇幅中，筆者也緊跟時(shí)代潮流，談?wù)劕F(xiàn)在打得火熱的雙光子顯微鏡的物鏡。

雙光子的成像原理使用過(guò)雙光子的同學(xué)們應(yīng)該都很清楚，不同于普通的光學(xué)顯微鏡和共聚焦系統(tǒng)所采用的線性光學(xué)，雙光子成像原理采用的是非線性光學(xué)，同時(shí)光源也不再是傳統(tǒng)的可見(jiàn)光，在物鏡的設(shè)計(jì)上不再是傳統(tǒng)那種“真實(shí)還原樣本”這樣的理念了。針對(duì)雙光子成像OLYMPUSzui早推出了雙光子成像的物鏡，在之后Nikon也緊跟步伐推出了相應(yīng)的產(chǎn)品。

雙光子物鏡首先zui重要的是NA值盡量的大，這樣可以有效的提高激發(fā)效率。同時(shí)，由于使用近紅外成像，物鏡的色差矯正也不再針對(duì)可見(jiàn)光而是專門對(duì)于近紅外光進(jìn)行矯正。在保證高NA的同時(shí)，雙光子物鏡的放大倍率會(huì)較小，這樣可以有效的提高收集視場(chǎng)，增加我們收集散射熒光信號(hào)的能力，從而提高成像質(zhì)量。當(dāng)然，這種雙光子物鏡只能使用在雙子系統(tǒng)上，若是在共聚焦系統(tǒng)中使用，效果是要大打折扣的。

本文來(lái)源于奧林巴斯中國(guó)，北京瑞科中儀專注顯微光學(xué)。