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大鼠核轉(zhuǎn)錄因子p65（NF-kB p65）ELISA試劑盒
原理
本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 NF-kB p65單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的 NF-kB p65與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠NF-kB p65，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，zui后加終止液硫酸，在450nm處測(cè)OD值，NF-kB p65濃度與OD值成正比，可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中NF-kB p65濃度。
試劑盒組成（2-8℃保存）
| 酶標(biāo)板（Coated Wells） | 96孔 | 酶標(biāo)抗體工作液（Enzyme Conjugate） | 12ml |
| 10×標(biāo)本稀釋液（Sample Buffer） | 12ml | 20×濃縮洗滌液（Wash Buffer） | 50ml |
| 標(biāo)準(zhǔn)品（Standards）：20ng/瓶 | 2瓶 | 底物工作液（TMB Solution） | 12ml |
| *抗體工作液（Biotinylated Antibody） | 12ml | 終止液（Stop Solution） | 12ml |
準(zhǔn)備試劑與收集血樣
1. 收集標(biāo)本：血清、血漿（EDTA）、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測(cè)，2-8℃保存48小時(shí)；更長(zhǎng)時(shí)間須冷凍（-20℃或-70℃）保存，避免反復(fù)凍融。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品液配制：使用前加入1ml蒸餾水混勻，配成20ng/ml的溶液。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管8管，*管加標(biāo)本稀釋液900ul，第二至第八管加入標(biāo)本稀釋液500ul。在*管中加入20ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至第二管。如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對(duì)照。
3. 10×標(biāo)本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。
4. 洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）
標(biāo)本激活方法
1. 將450ul標(biāo)本稀釋液加入到一支1.5ml進(jìn)口聚丙烯管中,再加10ul血清或血漿標(biāo)本。
2. 加20ul 1 N HCI,蓋緊，上下混勻。2－8℃放置60± 2分鐘。
3. 加20ul 1 N NaOH,蓋緊，上下混勻。
4. 即用，或放-20/-70℃保存3天。計(jì)算結(jié)果時(shí)乘以稀釋倍數(shù)50。（注意：不同的標(biāo)本NF-kB p65的水平可能有較大差異，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況靈活掌握稀釋度）
5. 細(xì)胞培養(yǎng)上清或組織勻漿10倍稀釋（410ul的標(biāo)本稀釋液＋50ul樣本＋20ul的1N HCI+20ul的1N NaOH）。
檢測(cè)程序
1. 加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品（已激活）100ul，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120分鐘。
2. 洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向?yàn)V紙上印干。
3. 每孔中加入*抗體工作液100ul。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60分鐘。
4. 洗板：同前。
5. 每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37℃30分鐘。
6. 洗板：同前。
7. 每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗處反應(yīng)15分鐘。
8. 每孔加入100ul終止液混勻。
9. 30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。
結(jié)果計(jì)算與判斷
1. 所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計(jì)算。
2. 以標(biāo)準(zhǔn)品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/ml為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3. 根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)NF-kB p65含量，再乘上稀釋倍數(shù)即可。
試劑盒性能
1. 靈敏度：zui小的NF-kB p65檢測(cè)濃度小于15pg/ml。
2. 特異性：可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的大鼠NF-kB p65。不與大鼠其它細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)。
3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板見變異系數(shù)均小于8.9％。
注意事項(xiàng)
1. 以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待測(cè)樣品均建議做復(fù)孔，每次測(cè)定應(yīng)同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2. 洗滌過(guò)程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致度誤差及OD值錯(cuò)誤地升高。
3. 板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。
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