摘要本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)介紹了一種快速測(cè)定食品中 β-胡蘿卜素的在線固相萃取-液相色譜分析方法。該方法以 C8 色譜柱作為分析柱，樣品經(jīng)皂化后直接進(jìn)樣，系統(tǒng)自動(dòng)完成目標(biāo)化合物的富集、凈化和分離等過(guò)程。通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了影響色譜分析的關(guān)鍵參數(shù)，并對(duì)方法學(xué)性能進(jìn)行了系統(tǒng)考察。結(jié)果表明，該方法滿足測(cè)定要求及現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法要求，并且具有簡(jiǎn)便、快速、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于樣品檢測(cè)需求較高的實(shí)驗(yàn)室中。

前言β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素之一，是維生素 A 的前體。它大量存在于植物中，是自然界中普遍存在且穩(wěn)定的天然色素。與其他類胡蘿卜素一樣，β-胡蘿卜素是一種抗氧化物，具有清除自由基的能力；作為維生素 A 的前體，β-胡蘿卜素可以轉(zhuǎn)化成維生素 A，是安全補(bǔ)充維生素 A 的產(chǎn)品，有助于維持眼睛和皮膚的健康、改善夜盲癥、皮膚粗糙狀況等，有很高的藥理學(xué)及營(yíng)養(yǎng)學(xué)價(jià)值。其廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食品添加劑及化妝品等行業(yè)，并且作為食品添加劑、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑和醫(yī)藥制劑使用。GB5009.83-2016規(guī)定的食品中 β-胡蘿卜素的測(cè)定方法通常包括皂化、石油醚的液-液萃取、旋蒸、氮吹和定容等樣品前處理過(guò)程，儀器方法分析時(shí)間近 40 min[1]。整個(gè)分析過(guò)程繁瑣、耗時(shí)，且 β-胡蘿卜素易被氧化，方法回收率和重現(xiàn)性難以保證。本文采用在線固相萃取-液相色譜法，將樣品皂化后直接上機(jī)分析，能夠快速測(cè)定其中的 β-胡蘿卜素含量。

實(shí)驗(yàn)部分試劑和樣品抗壞血酸 (VC, C6H6O6)、氫氧化鉀 (KOH)、2,6-二叔丁基-4-甲ji苯酚 (BHT) 和乙醇均為 HPLC 級(jí)，購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)室技術(shù)公司；甲醇和乙腈均為 HPLC 級(jí)，購(gòu)自 Merck；甲基叔丁基醚 (MTBE)為 HPLC 級(jí)，購(gòu)自 Tedia；β-胡蘿卜素（純度 99.9%）購(gòu)自 LGC公司；奶粉、液態(tài)奶購(gòu)自超市。儀器和設(shè)備采用安捷倫在線固相萃取-液相色譜系統(tǒng)，配備如下安捷倫模塊：Agilent1260InfinityII四元泵（部件號(hào)G7111B×2）、Agilent1260InfinityII自動(dòng)進(jìn)樣器（部件號(hào)G7129A）、Agilent 1260InfinityII柱溫箱（部件號(hào)G7116A，內(nèi)置2位6通閥）和 Agilent1260InfinityIIDAD（部件號(hào)G7117C，配備60mm超高靈敏度流通池）。軟件采用AgilentOpenLabCDS2.6。

標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液制備取 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于100mL棕色容量瓶中；向其中加入0.1gBHT，用二氯甲烷溶解并定容至刻度，制得 β-胡蘿卜素濃度為0.1049mg/mL的儲(chǔ)備溶液。將其避光儲(chǔ)存于–20°C下，有效期為1個(gè)月，臨用前使溶液回溫至20°C。標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備取標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液適量，加乙醇（含0.5gVC/L）稀釋25倍，制得濃度為4.196µg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品中間液；然后取該中間液適量，用 70% 乙醇（含0.5gVC/L）稀釋得到濃度為0.2098µg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液。樣品前處理取奶粉1.0g、液態(tài)奶 5 g，參照GB5009.83-2016的樣品前處理方法，將奶粉先用10mL溫水混勻，然后向其中分別加入1g抗壞血酸、45 mL 乙醇（含0.1gBHT）和15mL氫氧化鉀溶液(1g/mL)；搖勻后置于53±2°C的水浴鍋中；皂化 30 min 后取出，迅速冷卻到室溫；再加入 70% 乙醇（含0.4g/LVC），定容至100mL；然后在常溫下離心，取上清液進(jìn)樣分析。

結(jié)果與討論標(biāo)準(zhǔn)品和典型樣品分離結(jié)果按照上述方法得到的色譜圖如圖2所示。樣品中目標(biāo)峰的分離不受基質(zhì)成分干擾，便于對(duì) β-胡蘿卜素的總量進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在樣品溶液制備過(guò)程中，目標(biāo)化合物容易氧化，因此在皂化過(guò)程中加入 BHT，并用含有 VC 的 70% 乙醇溶液進(jìn)行定容，以盡可能減少全反式 β-胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化。

線性關(guān)系和定量限取標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液，分別進(jìn)樣 0.5、2、5、10、20、50 和100µL，以標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，考察方法線性。結(jié)果如圖 3 顯示，β-胡蘿卜素的線性方程為y=46.788x+1.9593，相關(guān)系數(shù) (R2) > 0.9999，表明 β-胡蘿卜素在0.1049–20.98ng范圍內(nèi)，獲得了良好的線性關(guān)系；按照S/N=10計(jì)算，儀器的定量限(LOQ) 為 0.07 ng，當(dāng)稱樣量為1g時(shí)，進(jìn)樣體積為100µL時(shí)，方法的定量限為0.07µg/g，優(yōu)于現(xiàn)行國(guó)標(biāo)方法[1]。

方法精度取濃度為0.2098µg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣 5 次，進(jìn)樣體積為100µL，計(jì)算目標(biāo)峰的峰面積和保留時(shí)間的RSD。計(jì)算得出，β-胡蘿卜素的保留時(shí)間RSD為0.02%，峰面積RSD為0.69%，表明該方法具有良好的精密度。

方法準(zhǔn)確度分別取空白溶劑（70% 乙醇）、奶粉和液態(tài)奶樣品，按照高、中、低三個(gè)水平加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并按照樣品溶液制備方法，制得待測(cè)溶液并上機(jī)分析；然后確定目標(biāo)物的總量，并計(jì)算加標(biāo)回收率。結(jié)果見表2。從表中可以看出，β-胡蘿卜素的高、中、低三水平加標(biāo)的平均回收率為101.98%，表明該方法整體測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度良好。

結(jié)論本應(yīng)用基于在線固相萃取技術(shù)初步建立了一種快速分析食品中 β-胡蘿卜素含量的方法。其中樣品經(jīng)皂化后可直接上機(jī)分析，系統(tǒng)將自動(dòng)完成目標(biāo)物的凈化、富集和分析全過(guò)程。該方法大幅簡(jiǎn)化了樣品前處理過(guò)程，并提高了樣品分析效率。初步方法學(xué)評(píng)估結(jié)果表明，該方法的線性、靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度均能滿足目標(biāo)化合物的定量要求，適用于測(cè)定實(shí)際樣品中 β-胡蘿卜素的含量。