細胞內信號通路，也稱為信號轉導級聯(lián)，在感知和整合不同的外部刺激以產生生物反應方面發(fā)揮著關鍵作用，最終導致細胞過程（增殖、遷移、分化、營養(yǎng)代謝……）。磷酸化反應是由激酶介導的翻譯后修飾，控制參與信號轉導蛋白質的活性。因此，它是感興趣途徑激活狀態(tài)的反映。

就磷酸化檢測而言，最佳檢測條件不僅取決于所研究的信號轉導途徑以及所研究的化合物（激活劑或抑制劑）的藥理學特征，還取決于用于檢測的特定細胞模型（貼壁或懸浮細胞、永生化細胞系或原代細胞、腫瘤、組織……）。正確優(yōu)化檢測條件對于確保獲得最佳的試劑使用和性能至關重要。

本文以HTRF®Advanced phospho-ERK1/2kit為例，為廣大研究者提供優(yōu)化磷酸化蛋白檢測的實用技巧，讓大家更深入地了解如何優(yōu)化過程中的各個步驟以獲得最佳的檢測結果。

圖1：Process flow for detecting GPCR-mediated ERK1/2 phosphorylation.Optimize preparation of working cells

TIP1：Optimize cell density for the best signal amplitude（優(yōu)化細胞密度）

HTRF信號與處理產生的磷酸化蛋白和總蛋白的量成正比，信號隨著磷酸化蛋白濃度增加而增加，如果檢測中磷酸化蛋白質的量明顯高于孔中存在的檢測抗體的量，則信號會下降（鉤狀效應）。有必要針對每個HTRF磷酸化或總蛋白檢測試劑盒、不同的細胞模型、甚至每個實驗條件進行細胞密度優(yōu)化，以避免鉤狀效應。

圖2：使用HTRF Advanced phospho-ERK1/2kit進行不同細胞密度檢測p-ERK，找到檢測最佳信號窗口的優(yōu)條件。每孔50K細胞密度會產生鉤狀效應，而每孔12.5K細胞密度條件可產生最佳信號。

TIP2：Optimize the presence of serum in the cell culture medium（血清饑餓處理）

根據(jù)要研究的信號通路，細胞饑餓處理可能有利于減少目標蛋白質的本底水平。通常情況下，從細胞培養(yǎng)基中去除血清是使細胞饑餓的有效方法，但對于某些細胞模型來說，血清的存在對于細胞生長或增殖至關重要。在這種情況下，可以選擇將血清濃度降低至0.5% 或不高于2%，同時應優(yōu)化血清饑餓的時間。

圖3：在此實驗中，2小時血清饑餓步驟（紅色曲線）實現(xiàn)了最佳的p-ERK檢測（S/B和EC50）。

TIP3：Distribute compounds in the presence of cell culture medium（在細胞培養(yǎng)基存在的情況下進行加藥處理）

在將化合物/藥物分配到細胞上之前，請勿從微孔板中除去細胞培養(yǎng)基。加藥步驟中去除培養(yǎng)基會對某些磷酸化蛋白檢測產生不良影響。在去除培養(yǎng)基加藥的情況下，高本底水平基本上掩蓋了任何誘導的藥理學劑量反應的檢測；當培養(yǎng)基存在的情況下加藥時，本底水平較低并且可以檢測到劑量反應（見圖4）。

圖4：直接加藥或去除培養(yǎng)基后加藥的檢測對比。結果表明，為了正確檢測劑量反應，必須在細胞培養(yǎng)基存在的情況下直接加藥處理。

TIP4：Optimize stimulation time（化合物刺激時間）

評估化合物刺激時間，找出產生最佳信號窗口的時間。

圖5：不同藥物刺激時間后，使用HTRF Advanced phospho-ERK1/2kit檢測p-ERK。結果表明，刺激細胞時間過短或時間過長都可能會降低信號窗口。

TIP5： Add lysis buffer shortly after removal of stimulation medium（藥物處理結束后盡快加入lysis buffer）

去除刺激介質后延遲添加裂解緩沖液可能會影響化合物的劑量反應。該實驗中，在去除刺激緩沖液后延遲不同時間后加入裂解液—— 5、10或30分鐘。結果顯示當延遲添加裂解緩沖液時，會對磷酸化ERK的檢測到產生不利影響。

圖6：在裂解步驟之前去除刺激緩沖液后等待時間的影響，去除培養(yǎng)基后必須立即添加裂解緩沖液。

通過上述實用技巧分享希望能夠幫助大家獲得最佳的檢測結果，此外，瑞孚迪磷酸化檢測不僅提供HTRF方案還有Alpha方案，同時還有干貨滿滿的優(yōu)化指南供大家參考，如有需要，就請與我們聯(lián)系吧