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克服強樣品溶劑效應(yīng)，實現(xiàn)液相色譜可持續(xù)性穩(wěn)定分析
近日，陶氏化學(xué)與安捷倫基于 1290 UHPLC 系統(tǒng)合作開發(fā)了一種溶于二氯甲烷（DCM）中且濃度低至 ppb 級別的雙酚 A 及其二縮水甘油醚衍生物混合物檢測方法，該套設(shè)備采用了具有 feed 進(jìn)樣模式的 hybrid multisampler，在該進(jìn)樣模式下，樣品以一定的進(jìn)樣速度注入流動相中，因此暫時稀釋樣品，克服了溶劑效應(yīng)，同時進(jìn)樣量可高達(dá) 45 μL，這種新的進(jìn)樣方法顯著提高了目標(biāo)物質(zhì)的檢測限（>20×）。
消費后再生材料（PCR）在消費品中的使用正在增長，而 PCR 必須滿足金屬和有機成分的法規(guī)要求，或通過與應(yīng)用相關(guān)的產(chǎn)品安全風(fēng)險評估。有機成分通常包括專門添加的提高產(chǎn)品性能的物質(zhì)（如抗氧化劑）和非添加的物質(zhì)（NIAS），其中非添加物質(zhì)（NIAS）包括了不同來源的幾類有機物質(zhì)，如污染物和降解物，可能對人體有害。
針對高分子量、非揮發(fā)性或者熱不穩(wěn)定的 NIAS，通常使用強溶劑（如二氯甲烷（DCM））提取樹脂，然后使用反相液相色譜（RPLC）分析。強有機溶劑在提取塑料材料中 NIAS 時最具效力，但它們通常對 RPLC 的應(yīng)用具有挑戰(zhàn)性。因為 NIAS 的組成可能會因塑料類型和 PCR 的來源而有很大差異，為了在 PCR 非靶向分析中涵蓋極性、疏水性和官能團(tuán)方面的廣泛有機分子，通常采用 C8 或 C18 作為固定相，流動相會從高比例水起始，到高比例有機改性劑（如乙腈或甲醇）結(jié)束來實現(xiàn)梯度洗脫，而當(dāng)樣品的溶劑（如二氯甲烷）洗脫強度遠(yuǎn)大于初始流動相組成的溶劑洗脫強度時，會對峰寬和峰形產(chǎn)生不利影響，尤其是對于早洗脫峰而言。
本文選擇 DCM 制備的濃度為 10 ppm 的雙酚 A（BPA）和 6 種雙酚 A 二縮水甘油醚（BADGE）衍生物的混合物作為樣品，首先采用經(jīng)典流通式進(jìn)樣模式，發(fā)現(xiàn)不同進(jìn)樣量和梯度洗脫中等度保持的流動相初始比例差異會帶來明顯的色譜圖結(jié)果差異，見圖 1。
圖 1.（A）使用 FT 進(jìn)樣時，進(jìn)樣體積為 2 μL 至 10 μL 時的色譜圖比較。將等度保持設(shè)置為 10% B（深藍(lán)色）或 20% B（淺藍(lán)色）3 min，然后開始梯度，在 276 nm 處記錄 UV 吸收。（B）放大 3 倍的色譜圖，顯示峰 3 和 4 的分辨率。
實驗表明，經(jīng)典的流通式進(jìn)樣模式下，只有進(jìn)樣量為 2 μL 時，才能獲得合適的峰形和分離度，結(jié)合使用高靈敏度 DAD 也不能獲得足夠的檢測限。而在 5 μL 和 10 μL 進(jìn)樣體積下，乙腈濃度從 10% 增加到 20%，各峰形及分離度均不佳，這主要是因為分析物溶解在 DCM 中，進(jìn)樣體積增加，導(dǎo)致分析物在柱頭上的捕獲更不充分，可見進(jìn)樣體積對分析物聚焦有很大影響。
針對這類樣品，傳統(tǒng)解決溶劑效應(yīng)的方式有：
1、使用較弱的混溶溶劑稀釋樣品溶液；
2、降低進(jìn)樣體積；
3、三明治進(jìn)樣或 co-injection 技術(shù)。
三明治進(jìn)樣或 co-injection 技術(shù)，是在吸樣之前抽取一段水填充 Loop，使樣品通過低洗脫溶劑聚焦在柱頭上或是使用進(jìn)樣程序?qū)悠放c初始流動相混合，從而降低樣品溶劑的整體強度。顯然，這兩個想法可以結(jié)合起來，并且可以調(diào)整其中吸入的液體的組成以獲得最佳結(jié)果。遺憾的是，樣品定量環(huán)中需有額外的溶劑填充，而這些進(jìn)樣技術(shù)的最大進(jìn)樣體積有限。以上這些方法即使讓峰形有所改善，也都會導(dǎo)致方法檢測限受到影響。當(dāng)然除了以上方法外，若有更合適的溶劑可選，可蒸發(fā)強溶劑并用新的溶劑重新溶解分析物，但其過程可能很費力并且可能造成分析物損失。也有文獻(xiàn)中表示可采用在線固相萃取方式，trap 柱捕獲分析物，隨后在分析色譜柱上進(jìn)行分離，但是這需要更復(fù)雜的儀器硬件和至少兩根填料色譜柱，方法優(yōu)化復(fù)雜，還需考查回收率等。
安捷倫 G7167C hybrid multisampler 除了經(jīng)典流通式進(jìn)樣模式（FT）外，還具有全新的 feed 進(jìn)樣模式（FI）。feed 進(jìn)樣模式可以減少樣品溶劑對分析物的洗脫，因為它使得樣品溶劑與洗脫液在柱前混合，這種短暫的稀釋與初始條件下分析物被色譜柱充分捕獲相結(jié)合，允許我們使用非常強的樣品溶劑，且不會產(chǎn)生額外的峰展寬或畸變。兩種注射方法的原理如圖 2 所示，在流通式進(jìn)樣時，通過切換自動進(jìn)樣器的進(jìn)樣閥，存儲在自動進(jìn)樣器樣品定量環(huán)中的樣品將會成為流路的一部分，以“液塞”的形式被流動相帶入色譜柱。采取 feed 進(jìn)樣模式，樣品會以一定速率（feed 速度）不斷被打入系統(tǒng)，在 feed 進(jìn)樣期間，液相輸液泵流量會因有來自于進(jìn)樣器的流量而減少，從而可以保持總流速不變。
圖 2. 樣品注入原理。(A) 流通式進(jìn)樣 FT；(B) Feed 進(jìn)樣 FI；流動相（橙色）的流向為從左往右，樣品（藍(lán)色）
FEED 進(jìn)樣速度的優(yōu)化
該實驗中，作者對比了進(jìn)樣器不同設(shè)置下進(jìn)樣 10 μL 樣品所得的色譜圖。在圖 1 中，20% 高乙腈濃度與 FT 注射相結(jié)合時會導(dǎo)致所有峰的干擾，但從圖 3 中看到，當(dāng)采用 feed 進(jìn)樣模式，使用 1% feed 速度時，峰 2-7 峰形及分離度顯著改善。同時，從圖 3A 可以看出 feed 進(jìn)樣模式下 feed 速度的設(shè)置很關(guān)鍵，會直接影響色譜分離效果，對比 10% 乙腈的等度保持分離的色譜圖可以看出，進(jìn)料速度為 10% 的 feed 進(jìn)樣與 FT 進(jìn)樣相比顯然沒有優(yōu)勢。但是隨著 feed 速度從 10% 逐漸調(diào)整到 0.5% 時，化合物 2 的峰寬降低至 0.113 分鐘，同時，峰對（峰 3 和 4）和三重峰（峰 5-7）的分辨率顯著提高，如圖 3B 所示。進(jìn)料速度從 1% 降低到 0.5% 僅顯示出輕微的改善，同時注射持續(xù)時間加倍。因此，當(dāng)進(jìn)料速度為 1% 且在 10% 乙腈下保持等度時，可獲得最佳結(jié)果。
圖 3.（A）不同進(jìn)樣模式對分離性能的影響。在 10 μL 進(jìn)樣體積下，比較 FT 進(jìn)樣與 0.5-10% feed 速度下 FI 所得色譜圖。10 % B（暗跡線）或 20 % B（亮跡線）的等度保持設(shè)置為 3 min，在 276 nm 處記錄 UV 吸收。（B）放大 3 倍的色譜圖，顯示峰 3 和 4 的分辨率。
等度保留時間的優(yōu)化
如上所述，F(xiàn)I 應(yīng)與足夠的捕獲條件相結(jié)合。需要考慮的另一點是梯度開始之前的等度保持持續(xù)時間。持續(xù)時間取決于進(jìn)樣量、recondition 溶劑量和 feed 速度，而 feed 速度又取決于 HPLC 泵的流速。為了減少等度保持持續(xù)時間并進(jìn)而縮短分析持續(xù)時間，最好選擇最高的進(jìn)料速度，同時保持所需的分離性能。當(dāng)液相泵的流速為 1.5 mL/min，20 μL 進(jìn)樣量下，進(jìn)料速度為 1% 時，進(jìn)樣時間為 1.3 分鐘。但對比圖 4 中 2-4 min 的等度保持時間下的色譜圖，發(fā)現(xiàn)等度保留 2 min 時保留時間最短的化合物（峰 1）的峰不僅顯著變寬，而且相對于調(diào)整的時間軸提前 0.64 分鐘洗脫。為了揭示這種行為的原因，運行了 DCM 溶劑空白（圖 4B 中的淺色軌跡），發(fā)現(xiàn) 2 min 等度保持時間下，DCM 與峰 1 共洗脫，很明顯，DCM 也保留在色譜柱上，因為其峰的前沿隨著等度保持時間的增加而延遲，因此等度保持時間要足夠長，只有這樣才能將 DCM 與目標(biāo)分析物分離。等度保持時間延長，梯度變化引起的基線下降與 DCM 峰前沿越來越近，這也很好說明了這一點。
圖 4. (A) 不同等度保持時間（圖中所示）對 1% 進(jìn)料速度（Vinj = 20 μL）FI 分離性能的影響。此外，還顯示了 5 μL FT 進(jìn)樣的 4 倍信號放大圖。每個樣品溶液色譜圖（深色）都疊加了 DCM-空白（淺色）。在 276 nm 處記錄 UV 吸收。(B) 227 nm 的波長下，并且未應(yīng)用時間軸調(diào)整或放大，其他條件與 (A) 相同。
提高進(jìn)樣量
當(dāng)進(jìn)樣速度為 1% 時，自動進(jìn)樣器的進(jìn)樣體積最大為 45 μL，無需手動調(diào)節(jié) recondition 溶劑體積。圖 5 比較了 feed 進(jìn)樣（45 μL）和 FT 進(jìn)樣（5 μL）下的色譜圖，對于關(guān)鍵峰對（峰 3 和 4）的分辨率，F(xiàn)I 顯示為 1.48，而 5 μL FT 注射產(chǎn)生的分辨率僅為 1.18。而將 feed 進(jìn)樣（45 μL）與 FT（2 μL）進(jìn)樣色譜圖進(jìn)行比較，在幾乎相同的分辨率下，F(xiàn)I 的注射量提高了 22.5 倍，也就是靈敏度可以提高 20 倍以上，這是一個實質(zhì)性的改進(jìn)。在該優(yōu)化條件下，根據(jù) 10 ppm 樣品溶液峰高響應(yīng)及噪聲來粗略地估算檢測限，檢測限（LOD）范圍在 1-10 ppb 之間。
圖 5. 1% feed 速度下 FI 最大進(jìn)樣量（Vinj = 45 μL）和 FT 進(jìn)樣（Vinj = 5 μL）的色譜圖的比較。10% 乙腈等度保持 2 min，在 276 nm 處記錄 UV 吸收。
在本研究中，作者通過 RPLC 和 UV 檢測實現(xiàn)了 DCM 中雙酚 A（BPA）和雙酚 A 二縮水甘油醚（BADGE）衍生物的大體積進(jìn)樣和分離。最初，經(jīng)典流通式進(jìn)樣模式下，只有注射量為 2 μL 時才有可能獲得合適的峰形和分辨率，而通過 hybrid multisampler 中新的 FI 的進(jìn)樣模式，既克服了強溶劑效應(yīng)，還可繼續(xù)增大進(jìn)樣量，從而極大提升了方法靈敏度。總體而言，F(xiàn)I 在受“強溶劑效應(yīng)”影響的各種應(yīng)用中具有很高的痕量分析潛力。
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