CD97 inhibits osteoclast differentiation via Rap1a/ERK pathway under compression

Subject terms: Orthodontics, Cell signalling

正畸治療是通過正畸牙齒移動（OTM）矯正咬合不正。OTM 是一種基于壓力-張力理論的機械生物學(xué)過程。壓力側(cè)的骨吸收是限速步驟，破骨細胞活化在骨代謝中起決定性作用。破骨細胞來源于單核細胞/巨噬細胞造血前體細胞，最終分化為成熟的破骨細胞。在正畸力刺激下，牙周成纖維細胞和成骨細胞釋放出一系列細胞因子，間接調(diào)節(jié)破骨細胞分化。

研究表明，機械刺激可以通過機械敏感受體（包括機械敏感離子通道和細胞粘附分子）直接調(diào)節(jié)破骨細胞分化。G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）是位于細胞膜表面的受體大家族，與破骨細胞分化和成熟密切相關(guān)。GPCRs 可以感知機械力并參與細胞內(nèi)生物過程。然而，GPCRs 是否通過感應(yīng)機械力參與破骨細胞生成仍是未知數(shù)。

CD97，也被稱為ADGRE5，是一種粘附類G 蛋白偶聯(lián)受體（aGPCR），這種分子在免疫系統(tǒng)疾病和上皮細胞衍生的惡性腫瘤中的作用已被充分證明，但最近，CD97 的機械感應(yīng)功能引起了越來越多的關(guān)注。然而，CD97 在牙周組織中的表達尚未見報道。此外，正畸力是否會改變 CD97 表達仍不清楚，CD97 是否調(diào)節(jié)破骨細胞分化或參與 OTM 也尚未闡明。

基于此，河北省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室及國家口腔醫(yī)學(xué)中心（四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院）的聯(lián)合團隊在一項研究中，使用 OTM 和靜態(tài)加壓應(yīng)用模型探索了 CD97 表達與破骨細胞分化之間的關(guān)系。CD97 被確定為抑制破骨細胞分化和 OTM 的潛在機械感應(yīng)分子。這些發(fā)現(xiàn)將有助于理解 OTM 的機制，并為加速牙齒移動提供潛在的治療靶點。研究成果發(fā)表在  International Journal of Oral Science  期刊題為“CD97 inhibits osteoclast differentiation via Rap1a/ERK pathway under compression”。

首先，分別分析了來自牙周組織和牙槽骨的單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)巨噬細胞亞群存在于牙周組織和牙槽骨中，CD97 在兩者的單核細胞/巨噬細胞簇中高度表達。

為了研究機械力對 CD97 表達的影響，將小鼠巨噬細胞系 RAW264.7 細胞暴露于 1 g/cm2 的靜態(tài)壓縮 2 小時（圖1 a）。Piezo1 的 mRNA 表達上調(diào)，表明壓縮力施加成功（圖1 b）。與對照組相比，CD97 mRNA 表達上調(diào)，而其他成員如 Gpr126、Gpr133 和 Gpr114 的表達下調(diào)。

此外，還檢測了 CD97 在不同受力和時間下的 mRNA 表達水平，發(fā)現(xiàn)其表達在 1 g/cm2 和 2 g/cm2 壓縮力刺激2 小時下以力依賴性方式上調(diào)（圖1 c）。在刺激的早期階段（1、2、4 h），靜態(tài)壓縮應(yīng)用顯著增強了CD97 mRNA的表達（圖1 d）。通過活性染色將 1 g/cm2 壓縮力持續(xù)4 小時確定為最佳壓縮條件。TRAP染色用于觀察和評估破骨細胞生成（圖1 e），破骨細胞的數(shù)量（圖1 f）和 TRAP-陽性細胞面積的百分比（圖1 g）在壓縮負荷和 RANKL 誘導(dǎo)的破骨細胞生成 7 天后顯著降低。

通過SEM 評估破骨細胞的骨吸收功能（圖1 h），與對照組相比，吸收陷窩（resorption pit）形成的數(shù)量（圖1 i）和面積（圖1 j）顯著降低。免疫熒光染色證實，靜態(tài)壓縮后壓縮負荷上調(diào)了 CD97 表達（圖1 k、l）。這些數(shù)據(jù)表明，靜態(tài)壓縮上調(diào)單核細胞-巨噬細胞中 CD97 的表達并抑制破骨細胞生成。

圖1    靜態(tài)壓縮上調(diào)單核細胞-巨噬細胞中 CD97 的表達并抑制破骨細胞生成。

接下來，為了探討 CD97 在正畸壓縮下牙周組織巨噬細胞中的表達，實驗建立了 OTM 模型，與第3天相比，第7天OTM距離顯著增加。通過 TRAP 染色，發(fā)現(xiàn)破骨細胞的數(shù)量從第 0 天到第 7 天增加。以F4/80分子為巨噬細胞標志物，檢測其在小鼠牙周組織中的表達，CD97+ F4/80+ 巨噬細胞的免疫熒光共定位顯示，第 3 天牙周組織中陽性細胞增多。CD97+ F4/80+ 巨噬細胞的數(shù)量逐漸減少，與OTM距離呈負相關(guān)。這表明，在早期正畸力負荷期間，CD97 在牙周組織巨噬細胞中的表達增加。

為了確定 CD97 在破骨細胞形成中的功能，特異性敲低 RAW264.7 細胞中的 Cd97 mRNA。TRAP 染色表明，CD97 的敲低刺激了破骨細胞的分化（圖2 a、b）。CD97 的缺失促進了吸收陷窩的形成（圖2 c、d）。在 CD97 敲低組中，偽足小體肌動蛋白環(huán)（Podosome actin Belt-）陽性破骨細胞的大小和數(shù)量增加（圖2 e、f）。此外，CD97 的敲低上調(diào)了與破骨細胞分化相關(guān)的基因的表達（圖2 g-j）。

為了確定單核細胞-巨噬細胞中的 CD97 對機械負荷的感應(yīng)，將RAW264.7 細胞在 CD97 敲低后暴露于靜態(tài)壓縮，1 g/cm2 的靜態(tài)加壓負荷4 小時后抑制破骨細胞的形成和吸收。敲低 CD97 部分恢復(fù)了在壓縮下的破骨細胞生成（圖2 a、b）。與此一致，破骨細胞吸收功能（圖2 c-f）和破骨細胞分化相關(guān)基因被恢復(fù)（圖2 g-j）。這些結(jié)果表明，CD97 可能是破骨細胞分化過程中重要的機械敏感受體。

圖2     CD97 介導(dǎo)破骨細胞分化中的機械轉(zhuǎn)導(dǎo)。

為了確定 CD97 在壓縮負荷下抑制破骨細胞分化的機制，對轉(zhuǎn)染陰性對照 shRNA（LV-shNC）和 CD97 shRNA（LV-shCD97）的 RAW264.7 細胞進行了 RNA 測序分析。結(jié)果表明，396 個基因上調(diào)，176 個基因下調(diào)。GO分析顯示，上調(diào)的基因集在 ERK1 和 ERK2 級聯(lián)反應(yīng)中富集。KEGG分析顯示，在壓縮刺激下，CD97 敲低的 RAW264.7 細胞中，Rap1 信號通路受到抑制，Rap1a 的表達下調(diào)。qRT-PCR 同樣證實了 CD97 敲低下調(diào)了 Rap1 信號通路的代表性基因表達，如 Rap1a、Epac1 和 Adcy6。

由于 Rap1 的活化通過抑制 ERK 通路在調(diào)節(jié)細胞功能中起重要作用，而ERK通路是破骨細胞分化所必需的，因此檢測了巨噬細胞中 Rap1a 和 ERK 的蛋白水平。CD97 敲低下調(diào) Rap1a 水平并上調(diào)磷酸化 ERK 表達。在壓縮刺激下，CD97 和 Rap1a 蛋白水平升高，磷酸化 ERK 表達降低。CD97 的敲低部分恢復(fù)了壓縮力下磷酸化的 ERK 表達。這表明，Rap1a/ERK 信號通路介導(dǎo) CD97 在壓縮刺激下對破骨細胞分化的影響。

最后，為了確定 Rap1a/ERK 信號是否參與機械力刺激下的破骨細胞分化，對RAW264.7 細胞施加靜態(tài)壓縮并添加 Rap1a 抑制劑GGTI298。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靜態(tài)壓縮抑制破骨細胞的形成和活性，而GGTI298 恢復(fù)了壓縮下的破骨細胞的分化和活性（圖3 a-d）。Western blotting 顯示，磷酸化的 ERK 表達因壓縮而下調(diào)，并且在 GGTI298 處理后被部分逆轉(zhuǎn)（圖3 e）。

然后，實驗在 OTM 期間對小鼠單側(cè)第一磨牙施用GGTI298，發(fā)現(xiàn)GGTI298注射加速了牙齒移動（圖3 f、g），牙周韌帶中的 TRAP 陽性細胞也增加（圖3 h、i）。 這些結(jié)果表明，機械力通過 Rap1a/ERK 信號調(diào)節(jié)破骨細胞分化和 OTM抑制Rap1a 可以刺激破骨細胞分化并加速 OTM。

圖3    機械力通過 Rap1a/ERK 信號調(diào)節(jié)破骨細胞分化和正畸牙齒移動。

總之，該研究揭示了 CD97 是一種新型機械敏感的 aGPCR，使巨噬細胞能夠感知壓縮并將此信息與 Rap1a/ERK 信號整合以抑制破骨細胞生成和 OTM（圖3 j）。具體來說，CD97 在牙槽骨和牙周組織的單核巨噬細胞中表達。壓縮上調(diào) CD97 表達并抑制破骨細胞分化。此外，CD97 介導(dǎo)的機械感覺及其下游 Rap1a/ERK 信號通路對于調(diào)節(jié)破骨細胞分化和阻礙早期牙齒移動至關(guān)重要。這種對壓縮如何影響破骨細胞分化的理解可能會對 OTM 中牙周組織的生物反應(yīng)產(chǎn)生新的機制見解，并最終為正畸治療提供新的策略。

參考文獻：Wang W, Wang Q, Sun S, Zhang P, Li Y, Lin W, Li Q, Zhang X, Ma Z, Lu H. CD97 inhibits osteoclast differentiation via Rap1a/ERK pathway under compression. Int J Oral Sci. 2024 Feb 4;16(1):12. doi: 10.1038/s41368-023-00272-x. PMID: 38311610; PMCID: PMC10838930.

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