在制藥行業(yè)中，通常使用分析儀器來評估某種產(chǎn)品是否符合要求的規(guī)范，以保證質(zhì)量和安全性。在美國藥典中，通用章節(jié)<1058>USP介紹了分析儀器確認(AIQ)的準(zhǔn)則，以確保所有儀器都能產(chǎn)生可靠且一致的數(shù)據(jù)。AIQ過程涉及在儀器使用壽命內(nèi)相互關(guān)聯(lián)的活動，以確定其目的的適用性。這些活動可分為以下四類(見圖1):

在本文中，對珀金埃爾默Lambda 365+紫外/可見分光光度計進行了操作確認。

圖1.分析儀器確認過程

紫外/可見分光光度計是一種用途廣泛的儀器，在制藥領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。當(dāng)在規(guī)定的環(huán)境中操作時，紫外/可見分光光度計(如應(yīng)用的任何其他儀器)需要經(jīng)過確認性驗證，并保證分析結(jié)果可靠且一致，從而滿足質(zhì)量要求。在國際藥典的特定章節(jié)中列出了相關(guān)指南，包括《美國藥典》(USP<857>)和《歐洲藥典》(EP 2.2.25)，其中詳細說明了驗證紫外/可見分光光度計性能的程序。雖然2019年對EP 2.2.25進行了修訂，但USP<857>的最新版本是2022年12月發(fā)布的。

在這些指南中，要求對紫外/可見分光光度計的性能進行驗證，以確認以下參數(shù)符合規(guī)定要求:

強烈建議使用國家和國際監(jiān)管機構(gòu)或認證機構(gòu)認可的認證參考物質(zhì)(CRM)進行測試，而不是使用更容易出錯的自制標(biāo)準(zhǔn)品。

LAMBDA 365+紫外/可見光分光光度計是一種基于單色器的分光光度計，通過電機驅(qū)動移動反光鏡和光柵來實現(xiàn)波長的選擇。這種選擇的準(zhǔn)確度至關(guān)重要，并且當(dāng)測量表現(xiàn)出窄吸收峰的樣品時變得更加重要。可以使用以下一個或多個標(biāo)準(zhǔn)品來控制波長光譜的紫外和可見光區(qū)的波長準(zhǔn)確度:

表1.用于波長控制的儀器參數(shù)--氧化鈰溶液、氧化鈥溶液、釹鐠玻璃

圖3.用于波長準(zhǔn)確度控制的高氯酸中氧化鈰的吸收光譜(為本標(biāo)準(zhǔn)品收集的六個光譜之一)

圖4.用于波長準(zhǔn)確度控制的高氯酸中4%氧化鈥溶液的吸收光譜(為本標(biāo)準(zhǔn)品收集的六個光譜之一)

圖5.用于波長準(zhǔn)確度控制的釹鐠玻璃的吸收光譜(為本標(biāo)準(zhǔn)品收集的六個光譜之一)用于波長控制的吸收峰位于681.02nm和875.74nm處

圖6.使用氧化鈰溶液、氧化鈥溶液和釹鐠玻璃控制紫外線、可見光和擴展可見光區(qū)(左側(cè)為USP<857>，右側(cè)為EP 2.2.25)波長的結(jié)果（點擊查看大圖）

紫外-可見分光光度計光度響應(yīng)的評估是確保讀數(shù)準(zhǔn)確無誤的基礎(chǔ)。當(dāng)按照朗伯-比爾定律進行定量分析以確定分析物濃度時，這變得更加重要。吸光度控制程序要求測量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在特定波長下的吸收值，以覆蓋預(yù)期的應(yīng)用光譜范圍，以及至少兩個吸光度水平范圍。將獲得的值與所用CRM的報告值進行比較，并檢查準(zhǔn)確度和精確度是否低于規(guī)定限值(見圖7)。

可使用的標(biāo)準(zhǔn)品如下:

在本文中，使用重鉻酸鉀(60mg/L和160mg/L)和三個中性密度玻璃濾光片。對于每個波長，收集六個重復(fù)樣品，并計算相應(yīng)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，如圖7和圖8所示。所有測試均順利通過，認證吸收率和實測吸收率之間的差異甚至比藥典標(biāo)準(zhǔn)要求的限值高出一個數(shù)量級。

表2.用于控制吸光度的儀器參數(shù)--重鉻酸鉀溶液

圖7.吸光度控制值--重鉻酸鉀溶液（點擊查看大圖）

圖8.吸光度控制值--中性密度玻璃濾光片（點擊查看大圖）

吸光度線性測試是吸光度控制的擴展，其中在預(yù)期光譜范圍內(nèi)測試光度響應(yīng)的線性。推薦用于控制吸光度的CRM和相同的儀器設(shè)置參數(shù)(見表3)也可用于控制紫外線和可見光區(qū)的吸光度線性。可接受標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，判定系數(shù)(R²)必須大于0.999。將吸光度測試控制過程中獲得的吸光度值與認證的吸光度值進行繪圖，以計算R²，R²為1.000，證實吸光度線性(見圖9)。最新版本的USP<857>不再需要此測試。

表3.用于控制吸光度的儀器參數(shù)--中性密度玻璃濾光片

圖9.吸光度線性測試的結(jié)果吸光度值是從吸光度控制測試中獲得的（點擊查看大圖）

雜散光是指到達探測器的所有不需要的輻射，即使這種輻射不是根據(jù)所選波長的帶寬選擇的。雜散光主要是由色散元件中的缺陷引起的，例如單色器的光柵組件、衍射效應(yīng)或損壞/磨損的組件。這導(dǎo)致了與朗伯-比爾定律的負偏差，并設(shè)置了儀器可能的最大吸光度值的上限。雜散光對于高濃度樣品來說更為重要，因為雜散光成分可能代表到達探測器的輻射的最大部分。截止濾光液用于確定雜散光限值。這些溶液吸收低于特定波長的光，同時透射更高波長的光。可以通過測量低于這種截止波長的吸光度來獲得雜散光，其中任何透射的光都是由雜散光提供的。推薦的CRM截止濾光液如下:

表4.用于雜散光限值的儀器參數(shù)

圖10.雜散光限值測試結(jié)果吸光度值等于10表明儀器已飽和（點擊查看大圖）

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分光光度計的光譜分辨率是指其將兩個相鄰峰分解為單獨峰的能力。分辨率與分光光度計的狹縫和用于收集光譜的數(shù)據(jù)點間隔有關(guān)。SBW(光譜帶寬)定義為在來自單色器的光帶最大強度的一半處測量的寬度，其與儀器的物理狹縫有關(guān)。通過在分光光度計中設(shè)置較低的狹縫值來選擇較低的SBW將保證分辨率更佳，盡管這可能會導(dǎo)致噪聲更大(穿過樣品的光會更少)。通常，建議將狹縫設(shè)置在分析物吸收帶FWHM(半峰全寬)的1/8左右。用于確定分光光度計光譜分辨率的CRM標(biāo)準(zhǔn)品如下:

通過測量在269 nm處收集到的最大吸收值和在266 nm處收集到的最小吸收值之比來確定光譜分辨率(已烷中甲苯的吸收光譜見圖11)。用于光譜分辨率測試的儀器設(shè)置參數(shù)如表5所示。266 nm和269 nm處的吸收值是使用處理方程獲得的，該處理方程從光譜中提取吸收值，然后減去在300 nm處獲得的基線?？梢院苋菀椎刂苯釉赨V WinLab軟件中創(chuàng)建處理方程。發(fā)現(xiàn)該比率等于2，并且由于驗收限值為A₂₆₉/A₂₆₆>1.3，測試順利通過(見圖12)。

表5.光譜分辨率測試的儀器參數(shù)

圖11.已烷 (0.020% v/v)溶液中甲苯的吸收光譜(用于光譜分辨率測試)（點擊查看大圖）

圖12. 光譜分辨率測試的結(jié)果（點擊查看大圖）