近日，中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所于International Journal of Pharmaceutics上發(fā)表題為“納米材料大小和濃度的關(guān)鍵參數(shù)以標(biāo)準(zhǔn)化納米顆粒跟蹤分析”的文章。該項(xiàng)研究中，作者系統(tǒng)性地評(píng)估了包括樣品構(gòu)成，樣品濃度，儀器設(shè)置參數(shù)，相機(jī)設(shè)置參數(shù)，液體流速對(duì)于NTA (NanoSight NS300) 測(cè)量準(zhǔn)確性的影響。在研究過程中，他們同時(shí)選取了顆粒粒徑表征的金標(biāo)準(zhǔn)——透射電子顯微鏡及基于電阻脈沖感應(yīng) (RPS) 原理的NanoCoulter納米庫爾特粒度分析儀進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，交叉驗(yàn)證NTA對(duì)顆粒粒徑及濃度測(cè)量的精度。

比較不同顆粒濃度下測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性

圖1樣品濃度對(duì)NTA測(cè)量結(jié)果的影響。

作者使用了不同大小的聚苯乙烯 (PS) 和二氧化硅 (SiO₂)標(biāo)準(zhǔn)顆粒，在不同的粒子濃度下進(jìn)行了測(cè)量，并比較了不同濃度下的平均尺寸和濃度偏差。結(jié)果顯示，當(dāng)粒子濃度在10⁸-10⁹ particles/mL之間時(shí)，測(cè)量結(jié)果最為準(zhǔn)確，線性趨勢(shì)最好。此時(shí)對(duì)應(yīng)視野內(nèi)的顆粒數(shù)為10-100和400-6500個(gè)。

比較不同曝光度對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響

圖2. 曝光度對(duì)NTA測(cè)量結(jié)果的影響

與DLS不同，NTA通過相機(jī)追蹤顆粒的實(shí)時(shí)的布朗運(yùn)動(dòng)進(jìn)行顆粒粒徑計(jì)算。因此優(yōu)化相機(jī)設(shè)置參數(shù)可以顯著提高NTA測(cè)得的粒徑和濃度的準(zhǔn)確性。作者使用了混合的不同尺寸的PS顆粒，在不同的曝光度 (camera level) 下進(jìn)行了表征。曝光度是表明相機(jī)對(duì)顆粒運(yùn)動(dòng)敏感程度的參數(shù)。通過調(diào)節(jié)曝光度，可以影響NTA的拍照結(jié)果。結(jié)果顯示，在曝光度為6-9時(shí)，100 nm的PS顆粒觀測(cè)不佳，而200 nm的PS顆粒清晰可見，當(dāng)曝光度為10-14時(shí)，100 nm的PS顆?？梢郧逦乇挥^測(cè)到，而200 nm的PS顆粒會(huì)過曝，影響結(jié)果。隨后作者進(jìn)一步評(píng)估了曝光度對(duì)100 nm，120 nm，150 nm，170 nm和200 nm的PS顆粒的粒徑峰值及分布進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，曝光度變化并未顯著影響PS顆粒的粒徑峰值，但是隨著曝光度上升，各組PS顆粒的粒徑平均值上升。因此作者認(rèn)為具體的不同大小的顆粒會(huì)與曝光度共同影響粒徑的測(cè)量結(jié)果。當(dāng)樣本分散度較大時(shí)，NTA相機(jī)難以找到合適的曝光度以保證可以拍到所有顆粒。在撰寫相關(guān)報(bào)告的時(shí)候，需要將NTA的曝光度等設(shè)定參數(shù)一并提交，以保證數(shù)據(jù)透明性。

比較不同不同泵速對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響

之前的研究已經(jīng)表明，溶液粘度會(huì)影響NTA測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性，但是對(duì)于泵速對(duì)測(cè)量結(jié)果有何影響仍是未知，因此作者使用了不同大小的PS顆粒，在不同的泵速下進(jìn)行了測(cè)量，并比較了不同速度下的平均尺寸和濃度偏差。結(jié)果顯示，對(duì)于小于200 nm的顆粒，泵速在50 AU (arbitrary unit)以內(nèi)可以得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果，而對(duì)于更大的顆粒，則需要更低的泵速才能保證準(zhǔn)確性。

圖4. NTA、DLS和RPS對(duì)多分散樣本的測(cè)量影響

隨后基于這些結(jié)果，作者按照該標(biāo)準(zhǔn)操作流程，評(píng)估了NTA對(duì)于多分散樣品的表征能力。作者制備了1: 1和10: 1（濃度比）的100 nm和150 nm PS顆?；旌衔?，根據(jù)不同的曝光度，NTA在7-10的范圍內(nèi)對(duì)兩個(gè)樣品都可以順利測(cè)量得出兩個(gè)粒徑峰位。隨后，作者進(jìn)一步制備了1: 1: 1的100 nm，150 nm和200 nm及1: 1: 1: 1的100 nm，150 nm，170 nm和200 nm的三混合和四混合樣本，結(jié)果表明NTA無法完成測(cè)量，僅能得出一個(gè)寬峰。隨后作者進(jìn)一步使用DLS和RPS對(duì)上述四個(gè)樣本進(jìn)行分析，DLS對(duì)于上述四個(gè)樣本都無法測(cè)量得到精確峰位，僅能得到一個(gè)單峰，而基于RPS理論的NanoCoulter通過單顆粒檢測(cè)手段，成功地測(cè)量出混合物的粒徑，并得出精確峰位。隨后作者進(jìn)一步驗(yàn)證了RPS的粒徑測(cè)量效果，制備了濃度比為1: 1: 1: 1的80 nm，120 nm，160 nm和200 nm的混合物。測(cè)量結(jié)果再次證實(shí)RPS可以順利地將混合物測(cè)出對(duì)應(yīng)的峰，并且不同的樣品峰之間區(qū)分明顯，分辨率良好。這種四分布樣品可以更真實(shí)的代表實(shí)際樣品。

最后，作者選取了兩種外泌體（分別來源于HEK293細(xì)胞和干姜），分別使用NTA，DLS和RPS技術(shù)進(jìn)行粒徑分析。結(jié)果表明在粒徑分析方面，NTA所得到的數(shù)據(jù)與TEM相似，而DLS粒徑值偏大，RPS所得粒徑結(jié)果偏小。在濃度方面，RPS表現(xiàn)出更精確的定量分析能力，這得益于RPS的單顆粒檢測(cè)技術(shù)，可以對(duì)每一個(gè)顆粒實(shí)現(xiàn)精確表征。

通過對(duì)實(shí)際樣品的測(cè)量，作者歸納總結(jié)了四種不同的顆粒表征方法的特點(diǎn)（表1）。作者認(rèn)為NTA在顆粒粒徑分析方面具有良好的分辨率和高準(zhǔn)確性，可以區(qū)分2-3種模態(tài)的樣本，但是對(duì)于外泌體類的樣本，NTA無法分辨外泌體，囊泡和脂蛋白，同時(shí)NTA也無法對(duì)不同來源的外泌體進(jìn)行區(qū)分。對(duì)于DLS，作者認(rèn)為該方法十分簡(jiǎn)便，微量樣本即可完成測(cè)量，但是該方法測(cè)得的粒徑值與真實(shí)情況相比偏差較大，并且該方法無法測(cè)量樣品顆粒濃度。TEM方法則可以直接實(shí)現(xiàn)樣本顆粒的可視化測(cè)量，但是該方法成本高昂，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。對(duì)于RPS，作者認(rèn)為該方法可以直接測(cè)量顆粒真實(shí)粒徑（尤其是未知樣本的顆粒特征情況下），并對(duì)多模態(tài)的混合樣本有良好的分辨率。

表1. 四種不同粒徑分析方法的特點(diǎn)匯總

通過該工作，作者系統(tǒng)的評(píng)估了包括濃度，儀器閾值，曝光度，泵流速等因素對(duì)NTA性能的影響，他們發(fā)現(xiàn)在濃度為10⁸~10⁹，泵流速為50AU時(shí)，對(duì)于顆粒樣本可以得到較為精確的表征結(jié)果，同時(shí)，他們也提出對(duì)于儀器閾值及曝光度這兩個(gè)參數(shù)，則需要結(jié)合樣本的粒徑具體問題具體分析。同時(shí)，他們也發(fā)現(xiàn)NTA對(duì)于多分散樣品分析能力不佳，而RPS則可以成功的區(qū)分三峰或四峰樣品，表明RPS對(duì)于多分散樣本具有更優(yōu)異的區(qū)分能力。同時(shí)作者選用多種表征手段對(duì)兩種外泌體進(jìn)行了分析，各個(gè)表征手段所得到的粒徑與濃度并不相同，因此作者認(rèn)為在進(jìn)行生物學(xué)顆粒研究時(shí)，需要運(yùn)用正交方法學(xué)對(duì)顆粒進(jìn)行多重表征。

參考文獻(xiàn)