本文要點：目前，鼻咽癌（NPC）的臨床治療策略面臨手術(shù)切除不wan全，化療/放療副作用顯著等難以克服的困境。光療為鼻咽癌治療提供了一種可操作、有效和非侵入性的模式。本文開發(fā)了一種溶酶體靶向和 pH 響應(yīng)的納米光療診斷劑，用于鼻咽癌的近紅外二區(qū)（NIR-II） 熒光成像引導(dǎo)光動力療法 （PDT） 和光熱療法 （PTT）。溶酶體靶向 S–D–A–D-S 型 NIR-II 光療分子 （IRFEM） 封裝在酸敏感兩親性 DSPE-Hyd-PEG2k 中，形成IRFEM@DHP納米顆粒 （NPs）。制備的IRFEM@DHP在酸性溶酶體中表現(xiàn)出良好的積累，促進(jìn)了IRFEM的釋放，IRFEM在激光照射下會產(chǎn)生大量的熱量和ROS，從而破壞溶酶體功能。此外，NIR-II熒光的指導(dǎo)提高了PTT/PDT對鼻咽癌的準(zhǔn)確性，避免了對正常組織的損傷。值得注意的是，IRFEM@DHP體外和體內(nèi)都能實現(xiàn)有效的抗腫瘤作用，為精確的鼻咽癌治療診斷開辟了一條新途徑。

活體成像

方案 1. 鼻咽癌 NIR-II 熒光成像引導(dǎo)溶酶體靶向光療的 IRFEM@DHP

在這項工作中，開發(fā)了一種溶酶體靶向和pH響應(yīng)的光療納米平臺，用于NIR-II熒光成像引導(dǎo)的鼻咽癌PTT/PDT聯(lián)合治療（方案1）。首先，基于之前報道的IR-FE分子合成了一種有機S-D-A-D-S型分子（IRFEM），研究者對此進(jìn)行了輕微的修改。IRFEM分子具有四個嗎啉基團的功能化，因此具有出色的溶酶體靶向能力。然后，用酸敏兩親性共聚物DSPE-Hyd-PEG2k包封IRFEM，得到IRFEM@DSPE-Hyd-PEG NPs（IRFEM@DHP）。IRFEM 旨在實現(xiàn)熒光、熱量和 ROS 生成能力的平衡，因此使其成為 NIR-II 成像引導(dǎo)的 PTT/PDT 聯(lián)合治療的理想候選者。制備的IRFEM@DHP可以通過增強滲透性和保留率（EPR）效應(yīng)在鼻咽癌細(xì)胞中富集，然后傾向于在酸性溶酶體中積累以釋放IRFEM。之后，IRFEM可以通過大量的嗎啉特異性靶向溶酶體，并在光照射下產(chǎn)生大量的熱量和ROS，從而誘導(dǎo)基于溶酶體的細(xì)胞死亡。總而言之，該IRFEM@DHP為鼻咽癌準(zhǔn)確的治療診斷提供了幾個顯著的好處：（i）廣泛而強烈的NIR-II發(fā)射提供了深度穿透的腫瘤成像，以促進(jìn)精確光療。（ii）通過S-D-A-D-S型分子的模塊化設(shè)計，可以操控產(chǎn)生PTT和PDT協(xié)同作用的特定光物理過程，從而提高腫瘤gen除能力。（iii）溶酶體靶向能力進(jìn)一步延長了IRFEM@DHP的保留時間，提高了PDT/PTT消除腫瘤細(xì)胞的效率。

圖1.  RFEM@DHP 的表征

如圖 1a 所示，IRFEM@DHP呈現(xiàn)出球形結(jié)構(gòu)，平均直徑為 124.9 ± 2.2 nm。平均流體動力學(xué)直徑和多分散指數(shù)（PDI）結(jié)果表明，IRFEM@DHP在7天內(nèi)相對穩(wěn)定。該IRFEM@DHP表現(xiàn)出 600 至900 nm 的強吸收范圍，當(dāng)在 808 nm 激發(fā)時，熒光發(fā)射峰位于 1030 nm（圖 1b）。此外，還系統(tǒng)地研究了IRFEM@DHP的光熱性質(zhì)。在808nm激光照射下，IRFEM@DHP溶液（60 μM）的溫度隨著激光功率密度的增加而升高（0.25–1.25 W/cm2）（圖1c）。同樣，不同濃度（10-100 μM）的IRFEM@DHP的溫度也隨著808 nm激光照射（1.0 W/cm2）而升高(圖1d）。此外，通過分析加熱和冷卻過程，確定IRFEM@DHP的光熱轉(zhuǎn)換效率為32.3%（圖1e）。IRFEM@DHP的出色光熱穩(wěn)定性表現(xiàn)在五個開關(guān)周期內(nèi)的變化可以忽略不計。這些結(jié)果表明，IRFEM@DHP具有優(yōu)異的光熱性能，在腫瘤PTT中具有巨大的潛力。使用2′，7′-二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）探針評估IRFEM@DHP的ROS生產(chǎn)能力，該探針可以通過ROS靈敏地轉(zhuǎn)化為熒光二氯熒光素（DCF）。如圖 1f–i 所示，IRFEM@DHP 在 808 nm 激光照射下呈現(xiàn)出恒定的 ROS 生成，這可以通過在 525 nm 處持續(xù)增強的熒光強度來證明。相比之下，IRFE@DHP輻照下的熒光強度隨時間變化不大。這些結(jié)果表明IRFEM@DHP具有良好的光動力性能。

圖2. IRFEM@DHP 的細(xì)胞攝取和溶酶體相關(guān)檢測

使用激光掃描共聚焦顯微鏡 （CLSM） 評估 5-8F 細(xì)胞對 IRFEM@DHP 的攝取能力。細(xì)胞內(nèi)熒光隨時間（0-6 小時）穩(wěn)步增加，表明 5-8F 細(xì)胞IRFEM@DHP表現(xiàn)出有效攝取。為了進(jìn)一步證實其溶酶體靶向能力，進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)溶酶體共定位成像。溶酶體示蹤紅 （LTR） 結(jié)合 IRFEM@DHP 用于鑒定溶酶體并評估其重疊。如圖2a所示，Pearson相關(guān)系數(shù)（PCCs）結(jié)果顯示IRFEM@DHP的熒光信號（藍(lán)色）和LTR（紅色）之間存在顯著重疊，PCC值為90.6%。相比之下，確定的IRFE@DHP共定位的 PCC 值相對較低，為 33.0%。如圖 2b 所示，IRFEM@DHP 和LTR 之間的線性區(qū)域中的強度分布wan全重疊。這些結(jié)果證實，由于嗎啉的存在，IRFEM@DHP可以有效地靶向溶酶體，為通過溶酶體細(xì)胞死亡（LCD）途徑精確gen除腫瘤細(xì)胞提供了可能性。

細(xì)胞毒性ROS可有效損傷溶酶體，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在 808 nm 激光照射后，通過 DCFH-DA 探針評估細(xì)胞 ROS 的水平。如圖 2c 所示，在 5–8F 細(xì)胞的 IRFEM@DHP+NIR 組中觀察到綠色熒光，表明 IRFEM@DHP 在 808 nm 激光照射下產(chǎn)生一定量的 ROS。值得注意的是，基于ROS的熒光定量分析，與IRFE@DHP+NIR組相比，IRFEM@DHP+NIR組的熒光強度高18.9倍，證實了嗎啉的引入增強了IRFEM@DHP ROS的產(chǎn)生。采用溶酶體膜通透性試驗，闡明IRFEM@DHP誘導(dǎo)LCD的機制。使用吖啶橙（AO）染料可以確認(rèn)溶酶體膜的完整性，因為AO在酸性溶酶體中捕獲時會發(fā)出紅色熒光，由于溶酶體質(zhì)子梯度紊亂，AO會泄漏到胞質(zhì)溶膠中，從而轉(zhuǎn)化為綠色熒光。如圖 2c 所示，IRFE@DHP 組和 IRFEM@DHP 組之間的紅色熒光沒有明顯差異，表明在沒有照射的情況下細(xì)胞損傷最小。然而，由于光熱效應(yīng)誘導(dǎo)的溶酶體膜完整性喪失，IRFE@DHP+NIR組和IRFEM@DHP+NIR組的紅色熒光明顯下降。此外，由于IRFEM@DHP+NIR組的紅色熒光明顯低于IRFE@DHP+NIR組，這是由于IRFEM@DHP具有突出的溶酶體靶向性和ROS生成能力。

圖3. 用不同濃度的 IRFE@DHP和 IRFEM@DHP處理的 5-8F 細(xì)胞的細(xì)胞活力，有或沒有 808 nm 激光照射

通過 CCK8 測定法評估 IRFEM@DHP 和 IRFE@DHP 對 5-8F 細(xì)胞的深色和淺色細(xì)胞毒性。如圖3a，b所示，在激光照射下IRFEM@DHP或IRFE@DHP細(xì)胞的活力比沒有激光照射的細(xì)胞活力低。探索了 IRFEM@DHP 對正常細(xì)胞 HC11 和 GES-1 的深色細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)它對正常細(xì)胞也無毒。IRFEM@DHP+NIR組的細(xì)胞活力為14.64%，明顯低于IRFE@DHP+NIR組的19.05%，表明IRFEM@DHP的光熱效應(yīng)而非光動力效應(yīng)在治療過程中占主導(dǎo)地位。為了直觀評估細(xì)胞毒性，使用鈣黃綠素乙酰氧基甲酯 （Calcein-AM） 進(jìn)行活/死染色測定，用綠色熒光染色活細(xì)胞，使用碘化丙啶 （PI） 用紅色熒光染色死細(xì)胞。如圖 3c 所示，在沒有近紅外光照射的情況下，處理 IRFEM@DHP 和 IRFE@DHP 可以觀察到廣泛的綠色熒光和可忽略不計的紅色熒光。激光照射后，與IRFEM@DHP或IRFE@DHP孵育后死細(xì)胞數(shù)量顯著增加，IRFEM@DHP的抗腫瘤效果比IRFE@DHP更明顯。這些結(jié)果強調(diào)了 IRFEM@DHP 對 NPC 細(xì)胞 PDT 和 PTT 能力。

圖4. 5-8F 荷瘤小鼠在注射后 0.5、1、2、5、8、12、24 和 48 小時處理IRFE@DHP 和 IRFEM@DHP 的實時熒光圖像

為了研究IRFEM@DHP的生物分布，使用攜帶5-8F腫瘤的雌性裸鼠通過體內(nèi)成像系統(tǒng)在不同的間隔（0.5, 1, 2, 5, 8, 12, 24和48小時）監(jiān)測熒光信號（圖4a）。尾部靜脈給藥后IRFEM@DHP，捕獲腫瘤的NIR-II圖像。結(jié)果顯示，熒光信號在0.5-24小時內(nèi)增強，表明腫瘤位置的IRFEM@DHP逐漸積累。熒光強度在注射后24小時達(dá)到峰值，隨后下降（圖4b）。這些成像結(jié)果表明，由于 EPR 效應(yīng)增強，IRFEM@DHP在腫瘤部位表現(xiàn)出良好的積累。注射后48小時，小鼠被anle dead，主要器官和腫瘤被切除并成像。肝臟和脾臟顯示出明顯的熒光信號，表明肝膽和脾臟納米顆粒具有明確的IRFEM@DHP和IRFE@DHP通路。腎臟和肺部熒光信號較高的原因可以概括為以下幾點。首先，在弱酸性腫瘤組織中釋放的IRFEM可以進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并被帶入器官細(xì)胞，從而保留更長的時間以引起更高的熒光信號。其次，與其他組織和器官相比，肺部具有更多的巨噬細(xì)胞和發(fā)育良好的溶酶體，因此導(dǎo)致更高的IRFEM@DHP保留（圖4c）。

圖5. 5-8F 荷瘤小鼠模型體內(nèi)構(gòu)建和處理的示意圖

為了評估IRFEM@DHP的體內(nèi)生物安全性，在注射后15天收獲小鼠的主要器官進(jìn)行組織學(xué)檢查（H&E染色）。結(jié)果表明，IRFEM@DHP組和對照組之間的主要器官組織沒有明顯的差異。收集所有小鼠的血樣進(jìn)行常規(guī)血液學(xué)和生化測定。結(jié)果表明，堿性磷酸酶（ALP）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（gamma-GT）、肌酐（CREA）、尿素（UREA）、尿酸（UA）等生化指標(biāo)在IRFEM@DHP組和PBS組間具有可比性，顯示出IRFEM@DHP具有優(yōu)異的體內(nèi)生物相容性。這些結(jié)果凸顯了IRFEM@DHP在抗腫瘤治療中的臨床轉(zhuǎn)化潛力。

為了評估IRFEM@DHP的體內(nèi)治療效果，使用雌性裸鼠構(gòu)建了 5-8F 荷瘤小鼠模型。如圖 5a 所示，將 5-8F 荷瘤小鼠分為6 組（PBS、PBS+NIR、IRFE@DHP組、IRFE@DHP+NIR、IRFEM@DHP 組和 IRFEM@DHP+NIR 組）。注射24小時后，將輻照組暴露于808nm激光（1.0W/cm2，10 分鐘）。熱成像結(jié)果顯示，IRFEM@DHP+NIR組的溫度顯著升高了17.7°C。在整個治療過程中每 2 天監(jiān)測一次腫瘤體積。結(jié)果顯示，腫瘤在PBS、PBS+NIR、IRFE@DHP組和IRFEM@DHP組中生長迅速。相比之下，在輻照IRFE@DHP組和IRFEM@DHP組中的腫瘤生長實現(xiàn)了更高的腫瘤抑制（圖5b，c）。值得注意的是，由于靶向溶酶體PTT/PDT聯(lián)合治療，IRFEM@DHP+NIR組的腫瘤重量比IRFE@DHP+NIR組輕（圖5d）。同時，所有組的體重都沒有明顯的波動意味著最小的副作用和IRFEM@DHP的出色生物相容性（圖5e）。

在治療結(jié)束時，從小鼠身上取出腫瘤，稱重并拍照。采用H&E、Ki-67法評估腫瘤組織的形態(tài)特征、細(xì)胞增殖和凋亡情況Ki-67 和 TdT 介導(dǎo)的 dUTP 缺口末端標(biāo)記 （TUNEL） 測定（圖 5f）。與其他組相比，IRFEM@DHP+NIR組腫瘤細(xì)胞形態(tài)明顯壞死，細(xì)胞輪廓模糊，細(xì)胞核消失。K我在IRFEM@DHP+NIR組中也監(jiān)測到Ki-67陽性信號和TUNEL信號，表明輻照IRFEM@DHP能有效誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。因此，這些結(jié)果凸顯了溶酶體靶向PTT/PDT聯(lián)合治療的優(yōu)異治療效果。

綜上所述，本研究開發(fā)了一種溶酶體靶向光療診斷劑，用于鼻咽癌的NIR-II熒光成像引導(dǎo)PTT/PDT聯(lián)合治療。嗎啉在IRFEM上的修飾使其對NPC具有精確的溶酶體靶向能力。因此，該IRFEM@DHP可以快速準(zhǔn)確地定位溶酶體，觸發(fā)IRFEM的pH響應(yīng)性釋放，在激光照射下通過PTT和PDT的組合引起溶酶體破裂。此外，IRFEM@DHP腫瘤中表現(xiàn)出出色的 NIR-II 熒光成像，顯示出 NPC 光療指南的顯著積累。因此，制備的IRFEM@DHP具有出色的活體成像、良好的生物相容性和溶酶體靶向的抗腫瘤光療，展示了精確鼻咽癌治療診斷學(xué)的范式。

參考文獻(xiàn)

Li Z, Yang S, Xiao H, et al. Lysosome-Targeted and pH-Activatable Phototheranostics for NIR-II Fluorescence Imaging-Guided Nasopharyngeal Carcinoma Phototherapy[J]. Bioconjugate Chemistry, 2024.