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細(xì)胞學(xué)堂 | 細(xì)胞轉(zhuǎn)染必看的常見問題盤點
細(xì)胞轉(zhuǎn)染是將外源性核酸（如DNA、RNA）引入細(xì)胞內(nèi)的一種技術(shù)，它主要用于基因表達(dá)、基因編輯（基因敲入/敲除）、蛋白質(zhì)功能以及細(xì)胞功能研究等。簡單來說，通過轉(zhuǎn)染，我們可以將新的遺傳信息帶入細(xì)胞，觀察這些信息對細(xì)胞行為的影響。
本期，我們將為大家?guī)?strong style="-webkit-tap-highlight-color: transparent; margin: 0px; padding: 0px; outline: 0px; max-width: 100%; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important; visibility: visible;">細(xì)胞轉(zhuǎn)染分類的介紹與常見問題解析，幫助您快速上手，確保細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗順利進(jìn)行。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染分類
根據(jù)轉(zhuǎn)染方式分類
化學(xué)轉(zhuǎn)染：
使用化學(xué)轉(zhuǎn)染試劑（如脂質(zhì)體、陽離子聚合物等）將核酸包裹并引入細(xì)胞。這種方法操作簡便，適用于多種細(xì)胞類型。
物理轉(zhuǎn)染：
利用物理手段（如電穿孔、顯微注射、基因槍等），使細(xì)胞膜暫時性開放或直接將核酸注入細(xì)胞。這種方法適用于部分難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型，但需要專業(yè)設(shè)備。
生物轉(zhuǎn)染：
利用病毒載體（如慢病毒、腺病毒等）將核酸導(dǎo)入細(xì)胞。病毒轉(zhuǎn)染效率高，但同時成本高且具有一定安全風(fēng)險。
根據(jù)轉(zhuǎn)染是否把外源核酸
整合到宿主染色體分類
瞬時轉(zhuǎn)染：
將外源性核酸引入細(xì)胞，使其在短時間內(nèi)表達(dá)目標(biāo)基因，不整合在細(xì)胞的染色體上。核酸在細(xì)胞內(nèi)僅存在較短時間，適合于需要快速獲取數(shù)據(jù)的實驗，能夠迅速檢測基因功能或表達(dá)。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：
將外源性核酸引入細(xì)胞，使其整合到細(xì)胞染色體中，實現(xiàn)長期表達(dá)。通過篩選和擴(kuò)增，雖然建立過程較長，但提供了穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)，適用于生產(chǎn)和長期研究。
細(xì)胞培養(yǎng)注意事項
01
如何選擇合適的轉(zhuǎn)染方法？
目前細(xì)胞轉(zhuǎn)染主要有物理、化學(xué)和生物三類轉(zhuǎn)染方法。物理轉(zhuǎn)染需要特定儀器、耗材及充分的轉(zhuǎn)染參數(shù)測試，才能獲得較好的轉(zhuǎn)染效果，一般實驗室無法滿足物理轉(zhuǎn)染的硬件要求；化學(xué)轉(zhuǎn)染是目前較為通用的一種方法，其憑借價格便宜、操作簡單而被廣泛使用；但部分類型細(xì)胞對化學(xué)轉(zhuǎn)染不敏感，轉(zhuǎn)染效率低，此類細(xì)胞可嘗試生物轉(zhuǎn)染方法，也就是通過病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。但是需要注意的是，如果細(xì)胞自身是難轉(zhuǎn)染類型，即使用病毒感染也不一定會獲得理想的轉(zhuǎn)染效果。
02
為什么細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率不高？
細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率不高可能是受到了以下因素的影響：
細(xì)胞類型和狀態(tài)：轉(zhuǎn)染試劑對不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率不盡相同；轉(zhuǎn)染前細(xì)胞狀態(tài)對轉(zhuǎn)染效率影響較大，此外，細(xì)胞密度也會影響轉(zhuǎn)染效率。
轉(zhuǎn)染試劑使用量：轉(zhuǎn)染試劑用量過多或過少都可能影響轉(zhuǎn)染效果，可根據(jù)說明書推薦的使用量進(jìn)一步梯度摸索，確定目標(biāo)細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件。
核酸質(zhì)量：使用的DNA或RNA質(zhì)量不佳（如降解或污染）會影響轉(zhuǎn)染效率。
轉(zhuǎn)染操作：例如制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物時孵育時間過長、轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞孵育時間不夠等都可能導(dǎo)致效率下降。
03
配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物時一定要用無血清培養(yǎng)基嗎？
通常在準(zhǔn)備核酸和轉(zhuǎn)染試劑稀釋液時，建議使用無血清的培養(yǎng)基或轉(zhuǎn)染試劑自帶的組分。因為血清中含有大量的蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)染過程中，蛋白質(zhì)可能干擾陽離子脂質(zhì)體/聚合物對核酸的吸附，影響轉(zhuǎn)染效率?，F(xiàn)在市售的部分轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行了一些改進(jìn)，可以在轉(zhuǎn)染時使用含血清的培養(yǎng)基，所以配制轉(zhuǎn)染復(fù)合物時，可根據(jù)使用的具體轉(zhuǎn)染試劑說明書，選擇是否使用無血清培養(yǎng)基。
04
電轉(zhuǎn)后細(xì)胞死亡率高，如何調(diào)整優(yōu)化？
細(xì)胞狀態(tài)：細(xì)胞電轉(zhuǎn)前，保證細(xì)胞生長狀態(tài)良好，排除細(xì)胞污染情況。
細(xì)胞密度：確保電轉(zhuǎn)細(xì)胞的密度適中，細(xì)胞密度過高或過低都可能影響轉(zhuǎn)染效果和細(xì)胞存活率。
電轉(zhuǎn)參數(shù)：優(yōu)化電壓、脈沖時間和脈沖次數(shù)，針對目標(biāo)細(xì)胞，確定最佳的電轉(zhuǎn)參數(shù)。
電轉(zhuǎn)緩沖液：使用合適的電轉(zhuǎn)緩沖液，確保能夠有效導(dǎo)電，同時減少細(xì)胞損傷。
05
轉(zhuǎn)染了抗性基因的細(xì)胞加藥篩選后，為什么都死了？
可能是受到了以下因素的影響：
加藥時間：細(xì)胞在轉(zhuǎn)染帶抗性基因的質(zhì)粒后，需要24-48 h表達(dá)抗性基因，避免過早加入藥物進(jìn)行篩選，一般建議轉(zhuǎn)染48 h后再加藥，具體時間可以預(yù)實驗摸索下。
加藥濃度：若藥物濃度設(shè)置過高，超過了抗性基因能夠應(yīng)對的范圍，導(dǎo)致即使轉(zhuǎn)染了抗性基因，細(xì)胞也無法存活。
抗性基因：抗性基因選擇錯誤或轉(zhuǎn)染過程中抗性基因發(fā)生突變或丟失，都會導(dǎo)致細(xì)胞抗性功能喪失。
以上是關(guān)于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的分類介紹與常見問題解析，更多細(xì)胞培養(yǎng)干貨，請持續(xù)關(guān)注細(xì)胞學(xué)堂專欄~
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