本文要點(diǎn)：光動(dòng)力療法（PDT）因其非侵入性和高選擇性而成為一種有前途的腫瘤治療方法。然而，光毒性的脫靶激活和腫瘤特異性生物標(biāo)志物的有限可用性等問題使PDT存在局限性 。本文介紹了一種新型比率型近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光有機(jī)納米探針BTz-IC@IR1061，該探針對(duì)腫瘤內(nèi)的次氯酸鹽（HClO）有特異性反應(yīng)。這種納米探針通過比例熒光成像來監(jiān)測(cè)和指導(dǎo)腫瘤活化PDT。BTz-IC@IR1061納米顆粒是將產(chǎn)生活性氧（ROS）的小分子染料BTz-IC與商業(yè)染料IR1061共摻雜來合成的。利用HClO可選擇性地激活 BTz-IC 的熒光和光動(dòng)力特性，同時(shí)破壞 IR1061，從而控制 ROS 的釋放用于腫瘤治療。本文研究證明了納米探針對(duì)HClO的高選擇性，同時(shí)具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性、光聲成像能力和光熱能力。此外，體內(nèi)研究顯示，通過腫瘤激活的光動(dòng)力療法，可以有效靶向腫瘤并顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)。研究結(jié)果表明 BTz-IC@IR1061 在腫瘤特異性光動(dòng)力療法方面具有潛力，為精準(zhǔn)和可控的癌癥治療提供了新的機(jī)會(huì)。

動(dòng)物活體成像

方案1. 比率NIR-II FL成像引導(dǎo)激活PDT癌癥治療的示意圖

在這項(xiàng)研究中，構(gòu)建了一種新型比率型近紅外二區(qū)（NIR-II） 熒光 （FL） 有機(jī)納米探針 （BTz-IC@IR1061），該探針對(duì)腫瘤內(nèi)的 HClO 有反應(yīng) （方案1)。該納米探針實(shí)現(xiàn)了比率 FL 變化和 PDT 激活，PDT 的激活通過比例 NIR-II FL 變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)。納米探針由兩個(gè)主要成分組成。成分是有機(jī)小分子染料BTz-IC，它通過在傳統(tǒng)供體-受體-供體（D-A'-D）核心的兩端引入兩個(gè)受體基團(tuán)，擴(kuò)展共軛系統(tǒng)以實(shí)現(xiàn)NIR-II FL 發(fā)射。在光照射下，BTz-IC分子產(chǎn)生羥基自由基（·OH）和單線態(tài)氧（1O2）通過I型和II型光動(dòng)力過程。第二種成分是商業(yè)花青染料IR1061。當(dāng)兩個(gè)分子共摻雜時(shí)，觀察到兩個(gè)分子之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），BTz-IC的光動(dòng)力性能也被淬滅。與HClO一起孵育后破壞了IR1061，恢復(fù)了BTz-IC分子的熒光和光動(dòng)力特性。PDT后，腫瘤部位發(fā)生炎癥，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，HClO濃度升高，進(jìn)而導(dǎo)致IR1061的破壞和腫瘤中比熒光和PDT的激活。最后，比率NIR-II熒光探針可以監(jiān)測(cè)活化PDT治療腫瘤過程。

圖 1. BTz-IC分子的合成路線和表征

BTz-IC分子的合成方法如圖1a所示。紫外和可見分光光度法（UV-vis）吸收光譜表明，BTz-IC分子在730 nm處有一個(gè)特征吸收峰（圖1c）。此外，熒光光譜顯示BTz-IC分子在850 nm至1100 nm范圍內(nèi)有強(qiáng)烈的發(fā)射（圖1d）。此外，IR1061的吸收光譜范圍為800nm至1100nm，與BTz-IC的熒光發(fā)射范圍重疊（圖1e）。因此，兩個(gè)分子之間的FRET可以淬滅BTz-IC的熒光。為了進(jìn)一步研究，使用表面活性劑DSPE-mPEG將這兩個(gè)小有機(jī)分子組裝成納米粒子（圖1b）。

最終使用的5:3比例合成了納米探針，并對(duì)其形態(tài)進(jìn)行了表征。透射電子顯微鏡（TEM）圖像BTz-IC@IR1061展示了尺寸為31nm的對(duì)稱球形納米粒子（圖1h）。此外，BTz-IC@IR1061納米粒子表現(xiàn)出高水溶性，動(dòng)態(tài)光散射（DLS）尺寸約為38 nm（圖1 g）。TEM和DLS尺寸一致。與此同時(shí)BTz-IC@IR1061在不同時(shí)間的不同溶劑（H2O、1640細(xì)胞培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖鹽水（PBS））中沒有顯著變化，表明顆粒具有良好的穩(wěn)定性。此外，測(cè)得的ζ電位為-25.1 mV。

圖2. BTz-IC@IR1061納米顆粒表征

通過用表面活性劑共摻雜這兩個(gè)分子來合成BTz-IC@IR1061在納米顆粒中，發(fā)生了FRET，淬滅了BTz-IC分子的熒光和光動(dòng)力特性。在與ClO—孵育后，IR1061被破壞，從而恢復(fù)了BTz-IC分子的熒光和光動(dòng)力特性（圖2a）。為了驗(yàn)證納米探針對(duì)ClO—的特異性響應(yīng)，本文對(duì)探針的選擇性進(jìn)行了研究。選擇了腫瘤中幾種常見且高表達(dá)的分析底物，即谷胱甘肽（GSH）、H2O2、1O2、O2·?、·OH和ClO—。納米探針分別與這些分析物一起孵育，如圖2b所示，添加其他底物（GSH、H2O2、1O2、O2·?、·OH）后，1064 nm處的吸收變化可以忽略不計(jì)。相比之下，隨著ClO—的加入，1064 nm處的吸收顯著降低。此外，在ClO—響應(yīng)前后測(cè)試了納米粒子的粒徑。在ClO—反應(yīng)后，納米粒子的大小沒有變化，這有效地表明只有IR1061被破壞了。通過NIR-II熒光研究了選擇性，如圖2c所示。在與GSH、H2O2、1O2、O2·?、·OH充分反應(yīng)后，808 nm和1064 nm激發(fā)的熒光保持不變。相反，當(dāng)與ClO—反應(yīng)時(shí)，由于IR1061的破壞導(dǎo)致FRET停止，808 nm激發(fā)的熒光增加，而1064 nm激發(fā)的熒光減少。此外，計(jì)算不同ROS反應(yīng)前后808 nm/1064 nm激發(fā)的熒光比表明，添加ClO—后的熒光比為0.94，而GSH、H2O2、1O2、O2·?、·OH和水的熒光比分別為0.32、0.29、0.30、0.31、0.32和0.32?？傊?，BTz-IC@IR1061僅對(duì)ClO—顯示出高選擇性（圖2d）。

在研究了納米探針的選擇性后，研究者開始驗(yàn)證BTz-IC@IR1061納米粒子在不同濃度ClO—下的反應(yīng)。將納米探針置于不同濃度的ClO—中，并測(cè)量其吸收和熒光。隨著ClO—濃度的增加，808 nm處的吸收保持不變，而1064 nm處的吸光逐漸降低。這一趨勢(shì)表明，盡管內(nèi)部參考分子BTz-IC不受影響，但I(xiàn)R1061逐漸被破壞。ClO—的檢測(cè)限為0.62μmol/L（圖2e）。此外，如圖2f和g所示，隨著ClO?濃度的增加，808 nm激發(fā)下的熒光增加，而1064 nm激發(fā)下的熒光減少。計(jì)算不同ClO?濃度下808 nm/1064 nm的熒光比，結(jié)果顯示，在20 μmol/L濃度下，熒光比高達(dá)123.25，而在0 μmol/L濃度時(shí)，熒光比為0.13（圖2h）?？傊撎结槍?duì)ClO—表現(xiàn)出優(yōu)異的檢測(cè)性能，并顯示出體內(nèi)研究的潛力。

圖3. NIR-II熒光成像監(jiān)測(cè)ClO—活化PDT

接下來，研究了ClO—激活BTz-IC@IR1061納米粒子進(jìn)行光動(dòng)力療法的性能，以驗(yàn)證光動(dòng)力療法的激活是否可以通過比率熒光監(jiān)測(cè)（圖3a）。通過使用不同濃度的ClO—與5:3的BTz-IC與IR1061反應(yīng)，驗(yàn)證了PDT的激活（圖3b和c）。在808 nm激光照射30秒后，1,3-二苯基異苯并呋喃（DPBF）在415 nm處的吸收隨著ClO—濃度的增加而顯著降低。這一結(jié)果歸因于隨著ClO—濃度的增加，納米探針之間的FRET受到更嚴(yán)重的破壞，導(dǎo)致BTz-IC分子的光動(dòng)力恢復(fù)并增強(qiáng)。此外，計(jì)算了照射30秒后415nm處的吸收（At）與照射前的吸收（A0）之比（At/A0）（圖3d）。在ClO—濃度為20 μmol/L時(shí)，該比值為0.591，而在0μmol/L ClO—時(shí)，該比率為0.879，表明ClO—反應(yīng)后PDT激活。

根據(jù)DPBF檢測(cè)到的ROS吸收變化，即使在極低激光照射條件（0.1 W/cm2）下照射10 s，415 nm處的峰值也急劇下降。這一觀察結(jié)果表明在分子的PDT過程中產(chǎn)生了大量的ROS，能夠通過I型光動(dòng)力學(xué)過程生成·OH等自由基，通過II型光動(dòng)力學(xué)過程生成1O2。以5,5-二甲基-1-吡咯烷N-氧化物（DMPO）和4-氧代-2,2,6,6-四甲基哌啶（TEMP）分別作為·OH和1O2的捕獲劑，通過電子自旋共振（ESR）證實(shí)了這一點(diǎn)。在光照射下，出現(xiàn)了TEMP/1O2加合物和DMPO/·OH加合物的特征共振信號(hào)峰，表明納米探針能夠同時(shí)生成·OH和1O2（圖3e和f）。此外，在水中加入 ClO? 進(jìn)行激光照射不會(huì)引起捕獲劑的特征峰出現(xiàn)，表明 ClO? 反應(yīng)后 PDT 的激活不涉及 ClO? 與捕獲劑的反應(yīng)。因此，納米探針表現(xiàn)出優(yōu)異的 ClO? 激活 PDT 和熒光性能的恢復(fù)，這是由于 BTz-IC 和 IR1061 之間的FRET 被破壞所致。

對(duì)納米探針 BTz-IC@IR1061 的光穩(wěn)定性進(jìn)行了檢測(cè)，即使在用 808 nm 激光照射 16 分鐘后，納米探針的紫外光譜仍保持不變，表明其具有良好的光穩(wěn)定性（圖 3g）。

此外，還研究了納米探針的光聲成像和光熱能力。納米探針在暴露于 808 nm 光時(shí)會(huì)產(chǎn)生熱量，與 ClO? 孵育后其光熱性能不受影響。此外，納米探針還表現(xiàn)出光聲成像能力，光譜中具有 BTz-IC和 IR1061 的特征峰（圖 3h 和 i）。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究在細(xì)胞和體內(nèi)水平上使用納米探針對(duì)腫瘤進(jìn)行成像和治療奠定了基礎(chǔ)。

圖4. BTz-IC@IR1061NPs不同時(shí)間兩個(gè)通道的NIR II熒光圖像（808 nm，Em>900 nm；1064 nm，Em>1100 nm）

BTz-IC@IR1061 納米探針在 ClO? 激活的 PDT 中表現(xiàn)出良好的特性，表現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性、光聲成像、光熱效應(yīng)以及產(chǎn)生 ROS 殺死癌細(xì)胞的能力。這些發(fā)現(xiàn)支持了納米探針在腫瘤 PDT 中的潛在應(yīng)用。

在驗(yàn)證了納米探針在溶液和細(xì)胞中均表現(xiàn)出顯著的 PDT 特性后，對(duì)癌癥的體內(nèi)成像進(jìn)行研究。研究者在 4T1 腫瘤小鼠模型中檢查了 BTz-IC@IR1061 的腫瘤富集效果。在患有皮下 4T1 腫瘤的 BALB/c 小鼠中靜脈注射 200 μL BTz-IC@IR1061 納米粒子（2 mg/mL），并在不同時(shí)間點(diǎn)捕獲光聲和 NIR 熒光圖像。腫瘤部位的光聲亮度隨時(shí)間逐漸增加，在注射后 8 小時(shí)達(dá)到峰值。此外，使用NIR-II熒光成像設(shè)備收集了通過靜脈注射納米粒子的小鼠熒光圖像。這些圖像顯示在808 nm和1064 nm激發(fā)下腫瘤區(qū)域的高對(duì)比度逐漸增強(qiáng)（圖4a），同時(shí)NIR-II熒光信號(hào)隨時(shí)間增加。值得注意的是，兩個(gè)激發(fā)通道中的熒光強(qiáng)度均隨時(shí)間增加。具體而言，在808 nm激發(fā)下，腫瘤區(qū)域的熒光在4小時(shí)時(shí)達(dá)到蕞大值，而在1064 nm激發(fā)下，熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)初始增加，然后降低，然后再次增加的模式。此外，在靜脈注射納米粒子4小時(shí)后，腫瘤區(qū)域的熒光在808 nm處達(dá)到蕞大值，而1064 nm處的熒光蕞低（圖4b和c）。這項(xiàng)觀察表明，納米探針在最初到達(dá)腫瘤部位時(shí)，被腫瘤內(nèi)存在的 ClO? 部分激活，隨著時(shí)間的推移，其腫瘤富集度增加，導(dǎo)致 1064 nm 處的熒光逐漸增加。來自腫瘤區(qū)域的可辨別的 NIR-II 熒光信號(hào)表明 BTz-IC@IR1061 納米粒子通過EPR 效應(yīng)具有有效的腫瘤靶向能力。

患有 4T1 腫瘤（小鼠乳腺癌）的 BALB/c 小鼠瘤內(nèi)注射 50 μL BTz-IC@IR1061 納米探針，30 分鐘后用 808 nm 激光照射7 分鐘（0.4 W/cm2）。圖 4d中所示的結(jié)果顯示，激光照射 1 小時(shí)后，1064 nm 處誘導(dǎo)的熒光與照射前水平相比逐漸降低，而 808 nm 處誘導(dǎo)的熒光則增加。相反，未接受激光照射的小鼠的熒光信號(hào)沒有顯著變化（圖4f 和 g）。將 808 nm 和 1064 nm 之間的熒光比標(biāo)準(zhǔn)化后，觀察到腫瘤照射 1 小時(shí)后熒光比增加了約 6 倍（圖 4e）。為了研究熒光比率變化的原因，使用了商業(yè) Gr-1 熒光探針來評(píng)估照射后不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤中的中性粒細(xì)胞表達(dá)。如圖 4h 所示，照射后不同時(shí)間間隔內(nèi)組織切片中 Gr-1 的熒光逐漸增加，隨后降低。這種模式可能歸因于照射后腫瘤內(nèi)的炎癥，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，熒光強(qiáng)度在 8 小時(shí)時(shí)達(dá)到峰值，隨后下降。現(xiàn)有文獻(xiàn)表明，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的增加會(huì)促進(jìn)腫瘤內(nèi) ClO? 濃度升高。因此，腫瘤內(nèi) ClO? 對(duì) IR1061 的逐漸降解可能導(dǎo)致了熒光比率的變化。此外，熒光的變化可以激活 PDT，從而允許通過比率熒光的變化監(jiān)測(cè)腫瘤治療。

對(duì)BTz-IC@IR1061 納米粒子評(píng)估其在小鼠中的治療效果。對(duì)患有4T1皮下腫瘤的BALB/c小鼠進(jìn)行四種治療條件：（i）PBS；（ii）808nm激光；（iii）BTz-IC@IR1061納米粒子；（iv）BTz-IC@IR1061納米粒子+808nm激光。如圖5a中的時(shí)間線所示，在腫瘤內(nèi)注射50μL BTz-IC@IR1061納米探針30分鐘后，對(duì)腫瘤進(jìn)行7分鐘的預(yù)照射，一小時(shí)后進(jìn)行第二次PDT治療。治療后每隔一天測(cè)量一次腫瘤體積。從腫瘤生長(zhǎng)曲線可以看出，用BTz-IC@IR1061+808nm激光治療的小鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制效果，治療14天后腫瘤消失。相反，對(duì)照組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)逐漸加?。▓D5b）。此外，治療14天后，各治療組小鼠體重均無明顯變化（圖5c），表明PDT對(duì)皮下腫瘤的有效性和生物安全性。治療24小時(shí)后，對(duì)腫瘤進(jìn)行病理檢查。組（iv）腫瘤切片經(jīng)蘇木精和伊紅（H&E）染色后，與其他組相比病理變化明顯，進(jìn)一步證實(shí)了PDT對(duì)治療實(shí)體腫瘤的有效性（圖5d）。此外，治療14天后，主要器官未見明顯異常，表明該給藥方法具有很高的生物安全性（圖5e）。

圖5. 小鼠PDT治療

總之，本研究描述了一種新型比率型 NIR-II 熒光有機(jī)納米探針，該探針被命名為 BTz-IC@IR1061。該納米探針由具有 A-D-A'-D-A 共軛結(jié)構(gòu)的有機(jī)小分子染料 BTz-IC 和商業(yè)染料 IR1061 組成。值得注意的是，BTz-IC 既可以通過 I 型光動(dòng)力過程生成 ·OH，又可以通過 II 型光動(dòng)力過程生成 1O2。當(dāng)通過表面活性劑組裝成親水性納米顆粒時(shí)，兩種有機(jī)分子之間會(huì)發(fā)生 FRET，從而導(dǎo)致 BTz-IC 的熒光和光動(dòng)力活性猝滅。當(dāng) IR1061 被 ClO? 破壞后，BTz-IC 的熒光和 PDT恢復(fù)，從而有利于比例 BTz-IC 熒光成像以監(jiān)測(cè) PDT。此外，PDT導(dǎo)致腫瘤部位中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，隨后HClO濃度升高，進(jìn)一步導(dǎo)致NIR-II熒光比例變化并激活PDT，此外，可以通過比例型NIR-II熒光變化來監(jiān)測(cè)腫瘤PDT的治療情況。

參考文獻(xiàn)

Yin B, Liu X, Li Z, et al. Ratiometric NIR-II fluorescent organic nanoprobe for imaging and monitoring tumor-activated photodynamic therapy[J]. Chinese Chemical Letters, 2024: 110119.