在細胞生物學(xué)領(lǐng)域，長非編碼RNA（lncRNA）因其在調(diào)控細胞過程中的復(fù)雜作用而備受關(guān)注，特別是它們在調(diào)控細胞分裂等關(guān)鍵生物過程中所扮演的角色。這些分子不僅參與調(diào)控細胞分裂的精細過程，還與基因組穩(wěn)定性密切相關(guān)。但lncRNAs的具體功能和作用機制，仍是科研領(lǐng)域的未解之謎。

最近，一項發(fā)表在《Nature Communications》上的研究，利用高內(nèi)涵細胞成像技術(shù)結(jié)合siRNA文庫篩選方案，為我們揭示了lncRNA在細胞分裂中的重要作用。接下來就跟小編儀器深入探究這項研究是如何巧妙地利用高內(nèi)涵細胞成像篩選技術(shù)結(jié)合siRNA文庫策略，成功挖掘出一篇影響因子高達12+的學(xué)術(shù)文章的奧秘吧！

研究背景

細胞分裂是生物體生長和維持組織功能的基礎(chǔ)。在這一過程中，染色體的準確分配至子細胞是至關(guān)重要的。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在細胞周期、分化、增殖和凋亡等多種細胞過程中扮演著調(diào)控者的角色。然而，大多數(shù)lncRNA的生物學(xué)功能仍然是一個謎。

研究方法

該研究由英國倫敦大學(xué)瑪麗皇后學(xué)院Lovorka Stojic研究組聯(lián)合劍橋大學(xué)Fanni Gergely及Duncan T. Odom研究組，通過靶向2000多個人類lncRNAs的高內(nèi)涵RNAi成像篩選，鑒定了許多參與細胞分裂關(guān)鍵步驟的lncRNAs，如染色體分離、有絲分裂持續(xù)時間和胞質(zhì)分裂。并揭示了與基因組穩(wěn)定性有關(guān)的幾種lncRNAs，以及控制微管行為并具有細胞分裂以外功能的lncRNA。

研究思路

01

siRNA文庫轉(zhuǎn)染，利用高內(nèi)涵篩選表型,發(fā)現(xiàn)LncRNA在細胞分裂不同階段具有功能，例如有絲分裂，染色體分離，胞質(zhì)分裂；

為了鑒定參與調(diào)節(jié)細胞分裂的lncRNAs，研究人員進行了兩次連續(xù)的RNAi篩選（篩選A和B），即將靶向2231個人類lncRNAs的siRNA文庫轉(zhuǎn)染HeLa細胞，并使用高內(nèi)涵篩選有絲分裂表型以檢查其效果。

02

確定相關(guān)LncRNA,對相關(guān)LncRNA的作用做進一步確認,使用不同表征方法；

03

利用RNA-Seq,對比RNAi和LNA介導(dǎo)LncRNA的功能缺失細胞中,基因轉(zhuǎn)錄差異。鑒定出linc00899相關(guān)的TPPP蛋白高表達。對TPPP高表達是否影響有絲分裂時間進行驗證,并對linc00899和TPPP之間的相互作用關(guān)系進行驗證；

04

TPPP作用于微管,所以研究linc00899對紡錘體中微管動態(tài)變化的控制。主要通過表型進行對比；

05

linc00899和TPPP之間的調(diào)控在不同細胞系的有絲分裂過程中均存在。linc00899和TPPP之間的調(diào)控分類,屬于trans,只有在內(nèi)源linc00899過表達時才能抑制TPPP的表達

主要發(fā)現(xiàn)

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研究發(fā)現(xiàn)linc00899這一染色質(zhì)相關(guān)的lncRNA，在多種細胞類型中，其耗竭會導(dǎo)致明顯的有絲分裂延遲。

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通過轉(zhuǎn)錄組分析linc00899耗竭的細胞，研究團隊鑒定出神經(jīng)元微管結(jié)合蛋白TPPP/p25作為linc00899的靶標。

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linc00899與TPPP/p25結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄，當linc00899耗竭時，TPPP/p25的上調(diào)改變了微管動力學(xué)并延遲了有絲分裂。

研究意義

這項研究不僅展示了lncRNA在維持基因組穩(wěn)定性中的多重角色，而且還揭示了linc00899通過控制微管行為來調(diào)控有絲分裂的新穎機制。這對于我們理解lncRNA在細胞周期進程中的功能以及它們在人類疾病，特別是癌癥中的作用具有重要意義。

技術(shù)亮點

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本文中利用了瑞孚迪（Revvity）的Opera高內(nèi)涵細胞成像技術(shù)結(jié)合siRNA文庫篩選方案，為研究lncRNA在復(fù)雜生物過程中的作用提供了一個強大的工具。

傳統(tǒng)的RNAi篩選技術(shù)通常只能針對單個或少量基因進行分析，而高內(nèi)涵RNAi篩選技術(shù)則能夠在單一實驗中同時分析數(shù)千個lncRNAs的功能。利用這一技術(shù)，可對大量lncRNAs在細胞分裂過程中的作用進行系統(tǒng)性篩選，并通過圖像分析算法對細胞的形態(tài)和分裂情況進行定量分析。這些數(shù)據(jù)經(jīng)過標準化處理后，利用統(tǒng)計方法可快速篩選出對細胞分裂具有顯著影響的lncRNAs。

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瑞孚迪的Opera平臺可提供高分辨率的細胞成像，捕捉細胞分裂過程中的細微變化。搭配Columbus軟件可進行自動化圖像分析流程，快速處理大量數(shù)據(jù)，識別關(guān)鍵細胞表型變化。

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這篇研究使用的The Lincode siRNA Library由Dharmacon提供，Dharmacon siRNA產(chǎn)品有如下特點：

SMARTselectionTM技術(shù)——高度特異性，確保沉默效率

SMARTpoolTM技術(shù)——無需驗證，保證至少75％靶基因沉默效率

雙鏈修飾技術(shù)，有效減少off-target并進一步提升沉默效率

在功能基因組學(xué)的研究中，瑞孚迪可提供了一系列的解決方案，包括高內(nèi)涵成像篩選系統(tǒng)、基因編輯技術(shù)、siRNA文庫、高通量篩選平臺等，這些工具和技術(shù)服務(wù)幫助科研人員更深入地理解基因的功能和基因間的相互作用，加速了從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。