“在HPLC日常分析工作中，有幾個(gè)常見(jiàn)的問(wèn)題一直困擾著我：色譜柱壽命太短；峰拖尾；保留時(shí)間重現(xiàn)性差；分不開(kāi)；保留弱等。”

遇到以上問(wèn)題該怎么去排查與優(yōu)化呢？
我們今天看一下色譜柱壽命短的問(wèn)題。
我們分析原因無(wú)非是：樣品臟、沒(méi)有色譜柱保護(hù)措施、色譜條件比較嚴(yán)。

01

—

樣品前處理

我們要了解樣品的來(lái)源，比如天然產(chǎn)物提取物、生物樣品、發(fā)酵產(chǎn)物、合成產(chǎn)物等。
  如果是天然產(chǎn)物提取物，我們要做的前處理工作是根據(jù)目標(biāo)物的性質(zhì)，富集目標(biāo)物，并除去色素等污染色譜柱的成分；
   如果是生物樣品，來(lái)源可能是生物組織、血液等，需要去除磷脂、蛋白等污染色譜柱的成分，并富集低含量的目標(biāo)組分；如果是發(fā)酵產(chǎn)物，需要去除發(fā)酵液中的糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、微生物細(xì)胞的破碎后的組分等，并富集低濃度的目標(biāo)組分；如果是合成產(chǎn)物，我們要了解反應(yīng)液的殘留成分、副產(chǎn)物、以及過(guò)量的原料等，對(duì)色譜柱產(chǎn)生污染的成分進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜コ?/span>

02

—

柱前保護(hù)

色譜柱的污染來(lái)源，一個(gè)是來(lái)自樣品，另一個(gè)是來(lái)自流動(dòng)相。我們?cè)谏V柱前面加一些保護(hù)措施，以防止來(lái)自樣品和流動(dòng)相的污染。在進(jìn)樣器前端可以加上在線過(guò)濾器，防止流動(dòng)相中的污染物進(jìn)入色譜柱；在色譜柱前端加上保護(hù)柱，以防止樣品中的強(qiáng)保留物等污染物進(jìn)入色譜柱，還可以對(duì)流動(dòng)相的污染物進(jìn)行二次防護(hù)。

03

—

色譜條件優(yōu)化

色譜柱壽命短的另外一個(gè)因素，就是色譜條件比較高。流動(dòng)相緩沖鹽濃度過(guò)高；流動(dòng)相pH太苛刻；柱溫過(guò)高；柱壓過(guò)高。

流動(dòng)相緩沖鹽濃度太高，那么緩沖鹽中的機(jī)械雜質(zhì)也可能更多，我們要將緩沖鹽進(jìn)行過(guò)膜抽濾處理；緩沖鹽濃度太高時(shí)，如果梯度后面有機(jī)相比例太高時(shí)會(huì)產(chǎn)生鹽析，堵塞混合器、進(jìn)樣器、色譜柱以及管路等，所以有機(jī)相比例不能太高，或者強(qiáng)洗脫相中加20%水。

一般硅膠基質(zhì)色譜柱的pH耐受范圍在2-6，如果pH低于2，硅膠的鍵合相易水解脫落，如果pH高于7，硅膠填料容易溶解流失。如果需用到苛刻的pH，那么建議使用耐寬pH的色譜柱。

一般廠家建議色譜柱耐受50℃以下柱溫，過(guò)高的柱溫可能會(huì)引起色譜柱壽命變短。

我們有的色譜條件會(huì)使柱壓比較高，比如流動(dòng)相的粘度太大（可以適當(dāng)升高柱溫或者更換粘度低的流動(dòng)相）；小粒徑色譜柱柱壓會(huì)更高（可以使用高柱效的核殼類色譜柱，大粒徑的核殼色譜柱柱效也不會(huì)降低較多）。