支原體(Mycoplasma)：目前發(fā)現(xiàn)的最小原核生物，據(jù)統(tǒng)計(jì)約15~35% 的細(xì)胞被支原體污染。支原體污染會(huì)改變宿主細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，易致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，須對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞定期進(jìn)行支原體檢測(cè)。

本試劑盒采用雙色熒光 qPCR (TaqMan 探針?lè)? 檢測(cè)支原體DNA。檢測(cè)對(duì)象為細(xì)胞培養(yǎng)的上清液，細(xì)胞沉淀或其他生物制品。該試劑盒具有以下特點(diǎn)：

靈敏：配合推薦使用的核酸抽提方案，檢測(cè)靈敏度達(dá)到10CFU/ml。

       可靠：抽提加入內(nèi)標(biāo)核酸，全過(guò)程質(zhì)量控制。

       穩(wěn)定：全程閉管操作，無(wú)交叉污染。

       方便：操作簡(jiǎn)單，無(wú)需電泳步驟。

表1   產(chǎn)品組分

注：

1、陽(yáng)性質(zhì)控含有支原體DNA和內(nèi)標(biāo)DNA。

2、內(nèi)部質(zhì)控含有內(nèi)標(biāo)DNA。

在實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)完整閱讀本說(shuō)明書，務(wù)必重視注意事項(xiàng)和無(wú)菌操作規(guī)范！

【操作步驟】

1.樣本制備

    （1）樣本的標(biāo)準(zhǔn)制備方案：請(qǐng)配合使用高效無(wú)微生物污染的DNA抽提試劑盒提取樣本DNA。整個(gè)過(guò)程需要遵守?zé)o菌操作規(guī)范。本公司目前推薦抽提試劑盒見(jiàn)附錄3。直接取20 µL待測(cè)樣本DNA，作為模板進(jìn)行 qPCR 反應(yīng)。

     （2）前處理陰性樣本準(zhǔn)備方案：將RNase Free Water當(dāng)成樣本，加入內(nèi)部質(zhì)控，進(jìn)行核酸抽提。

2. qPCR 反應(yīng)液的準(zhǔn)備

       （1）根據(jù)所要檢測(cè)樣品的數(shù)量，計(jì)算所需反應(yīng)孔數(shù)，每個(gè)樣本做3個(gè)重復(fù)孔。

     反應(yīng)孔數(shù)=1個(gè)陽(yáng)性PCR質(zhì)控+1個(gè)陰性PCR質(zhì)控+1個(gè)前處理陰性質(zhì)控+樣本數(shù)× 3

      （2）根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算所需的qPCR Mix 總量（需有1孔的加樣損失量）：

     Mix =（反應(yīng)孔數(shù)+1）×10 μl

      （3）各試劑放室溫融化，并根據(jù)下表所示準(zhǔn)備 qPCR Mix：

表2  qPCR Mix的配制

3. 加樣

      （1）震蕩混勻 qPCR Mix，低速離心，將管蓋殘留液體收集至管底。

      （2）向每孔反應(yīng)管中分裝 10 μL qPCR Mix。

      （3）向已分裝過(guò) qPCR Mix 的反應(yīng)管中加入15 ul石蠟油。

      （4）向反應(yīng)管中加入樣品后短暫離心，加樣示例如下：

      表 3 加樣示例

【注】：此時(shí)每個(gè)反應(yīng)孔的體積為30μL。

       qPCR 陰性的PCR模板為20 ul RNase Free Water。

PCR 儀設(shè)置以 ABI 7500 為例，相對(duì)定量模式，選擇TaqMan 探針?lè)ǎ?/span>

注：1、該程序?yàn)閮呻A段擴(kuò)增法，如熒光定量PCR儀可以兩階段收集熒光，按照正常Ct值判斷結(jié)果；如果只能最后一步收集熒光，需要在原數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上加15個(gè)Ct值。

   2、ROX設(shè)置是以7500為例，但也存在例外，例如StepOne。

【閾值設(shè)置】

  以ABI 7500 為例，擴(kuò)增曲線選擇 log 法，如果不能兩階段收集熒光，基線設(shè)置1~2個(gè)循環(huán)；如果可以，基線設(shè)置3-15個(gè)循環(huán)。建議用 log 法擴(kuò)增曲線保證結(jié)果穩(wěn)定可靠。

（1） 內(nèi)參(HEX/VIC)閾值設(shè)定：以陽(yáng)性對(duì)照定內(nèi)參擴(kuò)增曲線閾值，將內(nèi)參的Ct 值定為 28±2。

 （2）支原體(FAM)閾值設(shè)定：以陽(yáng)性對(duì)照定支原體擴(kuò)增曲線閾值，將支原體(FAM)的 Ct 值定為 28±2 。

【實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制】

如果陽(yáng)性對(duì)照管的支原體(FAM)Ct 值>30，但陽(yáng)性對(duì)照管及前處理陰性對(duì)照管的內(nèi)參(HEX)Ct 值正常，表明陽(yáng)性支原體對(duì)照模板有降解。

如果樣品前處理陰性的內(nèi)參（HEX/VIC)Ct 值>30，陽(yáng)性對(duì)照管的內(nèi)參(HEX)Ct 值>30 ，表明內(nèi)參DNA存在降解或PCR體系擴(kuò)增效率下降。

   【結(jié)果判讀】

根據(jù)支原體(FAM) Ct 值、內(nèi)標(biāo)(VIC) Ct 值判定，具體標(biāo)準(zhǔn)如下：

要求每個(gè)檢測(cè)樣品做3重復(fù)，如果3復(fù)孔中，兩重復(fù)為陽(yáng)性，則判讀為陽(yáng)性；建議做樣本前處理陰性，可以質(zhì)控整個(gè)抽提過(guò)程。

注：檢測(cè)結(jié)果異常時(shí)：

1. 樣品前處理陰性：內(nèi)參Ct值過(guò)大，表明抽提效率低；支原體檢測(cè)通道Ct值小于37.5，可能前處理抽提過(guò)程存在污染。

2. qPCR陰性：支原體和內(nèi)參檢測(cè)通道Ct值小于37.5，操作過(guò)程存在污染。

3. 樣本前處理陰性質(zhì)控和PCR陽(yáng)性質(zhì)控內(nèi)參差1±1個(gè)Ct值屬于正?，F(xiàn)象。

  【PCR過(guò)程注意事項(xiàng)】

由于 PCR 反應(yīng)非常靈敏，實(shí)驗(yàn)操作中應(yīng)注意以下事項(xiàng)，以免發(fā)生DNA 污染：

  1．試劑盒開(kāi)啟后，陽(yáng)性質(zhì)控和內(nèi)部質(zhì)控與試劑Biowing® MyqPCR Reaction Mix1、Biowing®MyPrimer&Probe Mix2、RNase Free Water、石蠟油分開(kāi)存放。

   2．每個(gè)組分在使用前都應(yīng)先低速離心后小心開(kāi)啟。使用時(shí)請(qǐng)上下輕柔顛倒十次混勻，避免起泡，并低速短暫離心后使用。

  3．要求核酸抽提和qPCR過(guò)程都符合無(wú)菌操作規(guī)范。

  4．建議自備轉(zhuǎn)運(yùn)盒，用于將配制分裝好的Mix從配置Mix超凈工作臺(tái)轉(zhuǎn)運(yùn)到加樣超凈工作臺(tái)。

  5．建議在 qPCR 反應(yīng)板上陽(yáng)性對(duì)照的排布應(yīng)遠(yuǎn)離待測(cè)樣本和陰性對(duì)照。

  6．建議 qPCR 配置與分裝在一個(gè)無(wú)菌操作臺(tái)，樣本的加樣在另外一個(gè)無(wú)菌操作臺(tái)。

  7．建議使用不同的移液器添加陽(yáng)性對(duì)照與待測(cè)樣本、陰性對(duì)照，并使用帶濾芯的槍頭進(jìn)行加樣。

  8．應(yīng)按照先加陰性，再加樣本，最后加陽(yáng)性的順序加樣。且陽(yáng)性用專門的加樣器。建議陽(yáng)性在專門的無(wú)菌操作臺(tái)加樣。

  9．qPCR 反應(yīng)板封膜或蓋蓋子時(shí)須反復(fù)壓緊。

 10．上機(jī)擴(kuò)增前，反應(yīng)管短時(shí)低速離心，將管壁液體收集至管底

 11．蓋上反應(yīng)管蓋子或者貼上光學(xué)膜后，為避免影響熒光信號(hào)讀取，請(qǐng)注意不要在管蓋或者膜上做標(biāo)記，或者用刮板反復(fù)摩擦。

 12．本產(chǎn)品僅作科研用途。