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對(duì)于微生物的生長及發(fā)酵，其培養(yǎng)基成份非常復(fù)雜，特別是有關(guān)微生物發(fā)酵的培養(yǎng)基，各營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子之間的配比，以及它們之間的相互作用是非常微妙的。面對(duì)特定的微生物，人們希望找到一種其生長及發(fā)酵的培養(yǎng)基，在原來的基礎(chǔ)上提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量，以期達(dá)到生產(chǎn)zui大發(fā)酵產(chǎn)物的目的。發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化在微生物產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中舉足輕重，是從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)生產(chǎn)的必要環(huán)節(jié)。能否設(shè)計(jì)出一個(gè)好的發(fā)酵培養(yǎng)基，是一個(gè)發(fā)酵產(chǎn)品工業(yè)化成功中非常重要的一步[2]。以工業(yè)微生物為例，選育或構(gòu)建一株優(yōu)良菌株僅僅是一個(gè)開始，要使優(yōu)良菌株的潛力充分發(fā)揮出來，還必須優(yōu)化其發(fā)酵過程，以獲得較高的產(chǎn)物濃度（便于下游處理），較高的底物轉(zhuǎn)化率（降低原料成本）和較高的生產(chǎn)強(qiáng)度（縮短發(fā)酵周期）[7]。設(shè)計(jì)發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)還應(yīng)時(shí)刻把工業(yè)應(yīng)用的目的留在腦海里[22]。
1 發(fā)酵培養(yǎng)基的成分
現(xiàn)代分離的微生物絕大部分是異養(yǎng)型微生物，它需要碳水化合物、蛋白質(zhì)和前體等物質(zhì)提供能量和構(gòu)成特定產(chǎn)物的需要[2]。其營養(yǎng)物質(zhì)一般包括碳源、氮源（有機(jī)氮源、無機(jī)氮源）、無機(jī)鹽及微量元素、生長因子、前體、產(chǎn)物促進(jìn)和抑制劑等。另外，在設(shè)計(jì)培養(yǎng)基時(shí)還必須把經(jīng)濟(jì)問題和原材料的供應(yīng)問題等因素一起考慮在內(nèi)[6]。
此外，還要考慮所篩選的菌種來源的地點(diǎn)環(huán)境，比如本實(shí)驗(yàn)室長期從事紅樹林微生物的分離及其研究工作，紅樹林的環(huán)境處于海洋與陸地之間，所以配制培養(yǎng)基所用的水除了一般的去離子水外還包括陳海水。
如果在知道產(chǎn)物結(jié)構(gòu)或者產(chǎn)物合成途徑的情況下，我們可以有意識(shí)地加入構(gòu)成產(chǎn)物和合成途徑中所需的特定結(jié)構(gòu)物質(zhì)。我們也可以結(jié)合某一菌株的特定代謝途徑，加入阻遏或者促進(jìn)物質(zhì)，使目的產(chǎn)物過量合成。例如青霉素的合成會(huì)受到賴氨酸的強(qiáng)烈抑制，而賴氨酸合成的前體α-氨基已二酸可以緩解賴氨酸的抑制作用，并能刺激賴氨酸的合成。這是因?yàn)?alpha;-氨基已二酸是合成青霉素和賴氨酸的共同前體。如果賴氨酸過量，它就會(huì)抑制這個(gè)反應(yīng)途徑中的*個(gè)酶，減少α-氨基已二酸的產(chǎn)量，從而進(jìn)一步影響青霉素的合成。
２ 發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)和優(yōu)化
由于發(fā)酵培養(yǎng)基成份眾多，且各因素常存在交互作用，很難建立理論模型；另外，由于測量數(shù)據(jù)常包含較大的誤差，也影響了培養(yǎng)基優(yōu)化過程的準(zhǔn)確評(píng)估，因此培養(yǎng)基優(yōu)化工作的量大且復(fù)雜[8]。許多實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法都在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化上得到應(yīng)用，如：生物模型（Biologicalmimicry）、單次試驗(yàn)（One at a time）、全因子法（Full factorial）、部分因子法（Partialfactorial）、Plackett andBurman法等。但每一種實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)都有它的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，不可能只用一種試驗(yàn)設(shè)計(jì)來完成所有的工作[22]。
2.1 單次單因子法
實(shí)驗(yàn)室zui常用的優(yōu)化方法是單次單因子（one-variable-at-a-time）法，這種方法是在假設(shè)因素間不存在交互作用的前提下，通過一次改變一個(gè)因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐個(gè)因素進(jìn)行考察的優(yōu)化方法。但是由于考察的因素間經(jīng)常存在交互作用，使得該方法并非總能獲得*的優(yōu)化條件。另外，當(dāng)考察的因素較多時(shí)，需要太多的實(shí)驗(yàn)次數(shù)和較長的實(shí)驗(yàn)周期[3]。所以現(xiàn)在的培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中一般不采用或不單獨(dú)采用這種方法，而采用多因子試驗(yàn)。
2.2 多因子試驗(yàn)
多因子試驗(yàn)需要解決的兩個(gè)問題1）哪些因子對(duì)響應(yīng)具有zui大（或zui?。┑男?yīng)，哪些因子間具有交互作用。（2）感興趣區(qū)域的因子組合情況，并對(duì)獨(dú)立變量進(jìn)行優(yōu)化[8]。
2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是安排多因子的一種常用方法，通過合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可用少量的具有代表性的試驗(yàn)來代替全面試驗(yàn)，較快地取得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。正交實(shí)驗(yàn)的實(shí)質(zhì)就是選擇適當(dāng)?shù)恼槐恚侠戆才艑?shí)驗(yàn)的分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一種實(shí)驗(yàn)方法。具體可以分為下面四步：（1）根據(jù)問題的要求和客觀的條件確定因子和水平，列出因子水平表；（2）根據(jù)因子和水平數(shù)選用合適的正交表，設(shè)計(jì)正交表頭，并安排實(shí)驗(yàn)；（3）根據(jù)正交表給出的實(shí)驗(yàn)方案，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；（4）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，選出較優(yōu)的“試驗(yàn)”條件以及對(duì)結(jié)果有顯著影響的因子[2]。
正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)注重如何科學(xué)合理地安排試驗(yàn)，可同時(shí)考慮幾種因素，尋找*因素水平結(jié)合，但它不能在給出的整個(gè)區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確的函數(shù)表達(dá)式即回歸方程，從而無法找到整個(gè)區(qū)域上因素的*組合和響應(yīng)面值的*值[4]。
正交方法可以用來分析因素之間的交叉效應(yīng)，但需要提前考慮那些因素之間存在交互作用，再根據(jù)考慮來設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。因此，沒有預(yù)先考慮的兩因素之間即使存在交互作用，在結(jié)果中也得不到顯示。
對(duì)于多因素、多水平的科學(xué)試驗(yàn)來說，正交法需要進(jìn)行的次數(shù)仍嫌太多，在實(shí)際工作中常常無法安排，應(yīng)用范圍受到限制[20]。
2.2.2 均勻?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)
如果僅考慮“均勻分散”，而不考慮“整齊可比”，*從“均勻分散”的角度出發(fā)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，叫做均勻設(shè)計(jì)。均勻設(shè)計(jì)按均勻設(shè)計(jì)表來安排實(shí)驗(yàn)，均勻設(shè)計(jì)表在使用時(shí)zui值得注意的是均勻設(shè)計(jì)表中各列的因素水平不能像正交表那樣任意改變次序，而只能按照原來的次序進(jìn)行平滑，即把原來的zui后一個(gè)水平與*個(gè)水平銜接起來，組成一個(gè)封閉圈，然后從任一處開始定為*個(gè)水平，按圈的原方向和相反方向依次排出第二、第三水平[9,13]。均勻設(shè)計(jì)只考慮試驗(yàn)點(diǎn)在試驗(yàn)范圍內(nèi)均勻分布，因而可使所需試驗(yàn)次數(shù)大大減少。例如一項(xiàng)５因素10水平的試驗(yàn)，若用正交設(shè)計(jì)需要做102次試驗(yàn)，而用均勻設(shè)計(jì)只需做10次，隨著水平數(shù)的增多，均勻設(shè)計(jì)的*性就愈加突出。這就大大減少了多因素多水平試驗(yàn)中的試驗(yàn)次數(shù)[19]。
2.2.3 Plackett-Burman法
Plackett-Bunnan設(shè)計(jì)法是一種兩水平的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方法[22]，它試圖用zui少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)達(dá)到使因子的主效果得到盡可能的估計(jì)，適用于從眾多的考察因子中快速有效地篩選出zui為重要的幾個(gè)因子，供進(jìn)一步優(yōu)化研究用。理論上Plackett-Bunnan設(shè)計(jì)法可以達(dá)到99個(gè)因子僅做100次試驗(yàn)，但該法不能考察各因子的相互交互作用[22]。因此，它通常作為過程優(yōu)化的初步實(shí)驗(yàn)，用于確定影響過程的重要因子[14]。許多文獻(xiàn)都對(duì)此有報(bào)道[28]。Castro PML報(bào)道用此法設(shè)計(jì)20種培養(yǎng)基，做24次試驗(yàn)，把gamma干擾素（gammainterferon）的產(chǎn)量提高了45%[23]。
2.2.4 部分因子設(shè)計(jì)法
部分因子設(shè)計(jì)法與P1ackett-Burman設(shè)計(jì)法一樣是一種兩水平的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化方法，能夠用比全因子實(shí)驗(yàn)次數(shù)少得多的實(shí)驗(yàn)，從大量影響因子中篩選出重要的因子。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合出一次多項(xiàng)式，并以此利用zui陡爬坡法確定zui大響應(yīng)區(qū)域，以便利用響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化。部分因子設(shè)計(jì)法與Plaekett-Burman設(shè)計(jì)法相比實(shí)驗(yàn)次數(shù)稍多，如6因子的26-2部分因子設(shè)法需要進(jìn)行20次實(shí)驗(yàn)，而Plackett-Burman設(shè)計(jì)法只需要7次實(shí)驗(yàn)[14]。
2.2.5 響應(yīng)面分析法
響應(yīng)面分析（response surfaceanalysis，RSM）方法是數(shù)學(xué)與統(tǒng)計(jì)學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物，和其他統(tǒng)計(jì)方法一樣，由于采用了合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，能以的方式，用很少的實(shí)驗(yàn)數(shù)量和時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全面研究，科學(xué)地提供局部與整體的關(guān)系，從而取得明確的、有目的的結(jié)論。它與“正交設(shè)計(jì)法”不同，響應(yīng)面分析方法以回歸方法作為函數(shù)估算的工具，將多因子實(shí)驗(yàn)中，因子與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相互關(guān)系，用多項(xiàng)式近似，把因子與實(shí)驗(yàn)結(jié)果（響應(yīng)值）的關(guān)系函數(shù)化，依此可對(duì)函數(shù)的面進(jìn)行分析，研究因子與響應(yīng)值之間，因子與因子之間的相互關(guān)系，并進(jìn)行優(yōu)化[2]。近年來較多的報(bào)道都是用響應(yīng)面分析法來優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，并取得比較好的成果[24,25,26,27]。
RSM有許多方面的優(yōu)點(diǎn)，但它仍有一定的局限性。首先，如果將因素水平選的太寬，或選的關(guān)鍵因素不全，將會(huì)導(dǎo)致響應(yīng)面出現(xiàn)吊兜和鞍點(diǎn)。因此事先必須進(jìn)行調(diào)研，查詢和充分的論證或者通過其它試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出主要影響因子；其次，通過回歸分析得到的結(jié)果只能對(duì)該類實(shí)驗(yàn)作估計(jì)；第三，當(dāng)回歸數(shù)據(jù)用于預(yù)測時(shí)，只能在因素所限的范圍內(nèi)進(jìn)行預(yù)測[4]。響應(yīng)面擬合方程只在考察的緊接鄰域里才充分近似真實(shí)情形，在其他區(qū)域，擬合方程與被近似的函數(shù)方程毫無相似之處，幾乎無意義[15]。
中心組合設(shè)計(jì)是一種上較為常用的響應(yīng)面法，是一種5水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法。采用該法能夠在有限的實(shí)驗(yàn)次數(shù)下，對(duì)影響生物過程的因子及其交互作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，而且還能對(duì)各因子進(jìn)行優(yōu)化，以獲得影響過程的*條件[14,18]。
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