表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是目前分子生物學(xué)研究的熱點之一，DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要內(nèi)容，是基因組DNA的主要表觀遺傳修飾形式之一。DNA甲基化修飾對于維持正常細(xì)胞功能、傳遞基因組遺傳印記、胚胎發(fā)育、衰老以及人類tumour發(fā)生，起著至關(guān)重要的作用。

全基因組甲基化研究方法主要有全基因組甲基化芯片、全基因組甲基化重測序(WGBS)和簡化亞硫酸氫鹽測序技術(shù)（RRBS），這些方法其實都有個共同的特點：信息量大，得到差異甲基化區(qū)域（DMR）非常多，但是價格昂貴，對個別區(qū)域覆蓋度和測序深度不足，可能會導(dǎo)致遺漏或假陽性結(jié)果。因此，對這些方法篩選出來DMR，需要做進(jìn)一步的驗證，在隊列樣本中對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行甲基化檢測，并分析目標(biāo)區(qū)域與疾病/性狀的關(guān)聯(lián)，才能進(jìn)一步為疾病與該DMR的關(guān)聯(lián)提供流行病學(xué)的證據(jù)。

Hi-MethylSeq簡介

目標(biāo)區(qū)域甲基化重測序（Hi-MethylSeq），又叫重亞硫酸鹽擴(kuò)增子測序（Bisulfite Amplicon Sequencing，BSAS）。在前期全基因組甲基化測序、全基因組甲基化芯片等工作基礎(chǔ)上，或者依據(jù)文獻(xiàn)報道目的基因甲基化與性狀/疾病關(guān)聯(lián)，選擇感興趣的目的區(qū)間或候選基因，利用Hi-MethylSeq技術(shù)對大規(guī)模群體的候選基因甲基化水平進(jìn)行檢測。

Hi-MethylSeq技術(shù)通過亞硫酸氫鹽（bisulfite）處理，用多重PCR擴(kuò)增目的片段，添加barcode和測序通用接頭，在Illumina X10二代測序平臺對PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，利用生物信息學(xué)方法，精確定量計算目標(biāo)區(qū)間內(nèi)的甲基化位點的甲基化狀態(tài)，在完成目標(biāo)區(qū)域檢測的同時大幅降低研究費用。

優(yōu)勢及應(yīng)用方向

1、優(yōu)勢

Hi-Methylseq結(jié)合了亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換、靶向擴(kuò)增子高通量測序技術(shù)，可實現(xiàn)多區(qū)段、多位點的甲基化精確定量分析，特別適合隊列樣本目標(biāo)區(qū)域的甲基化分析，測序深度高，結(jié)果更加準(zhǔn)確。

2、應(yīng)用

（1）適用于感興趣的目的片段甲基化研究 ；

（2）適用于在大樣本中進(jìn)一步確認(rèn)全基因組甲基化研究挑選的陽性位點（DMR）。

3、方向

農(nóng)口：表觀遺傳學(xué)研究、品種鑒定、品種改良

醫(yī)口：tumour早期診斷、表觀遺傳學(xué)生物標(biāo)志物開發(fā)、tumour復(fù)發(fā)的**預(yù)測因子

Hi-MethylSeq關(guān)鍵結(jié)果

結(jié)果對比

與標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果一致，但更有優(yōu)勢

Hi-MethylSeq與BSP結(jié)果一致，而Hi-MethylSeq在研究DNA甲基化時，每一個read 都相當(dāng)于克隆測序時的一個單克隆，每個區(qū)段得到成千上百個reads,所以用二代測序比亞硫酸氫鹽修飾后的克隆測序技術(shù)得到的結(jié)果更加精確。

應(yīng)用案例1

復(fù)發(fā)性妊娠丟失（RPL）是指妊娠24周前連續(xù)兩次或兩次以上的自然流產(chǎn)懷孕，占育齡夫婦的1%。表觀遺傳因素，包括某些基因表達(dá)DNA甲基化調(diào)控紊亂可能在RPL中起作用?？蒲腥藛T利用全基因組甲基化重測序和轉(zhuǎn)錄組測序聯(lián)合分析，鑒定蛻膜和血液中DNA甲基化調(diào)控的RPL相關(guān)基因，并使用翼和生物Hi-MethylSeq進(jìn)行case和control組的關(guān)鍵基因DMR甲基化檢測。終發(fā)現(xiàn)，SGK1和CREB5的異常甲基化可能是神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)的原因之一，這些基因位于子宮內(nèi)膜，可能是導(dǎo)致生殖失敗的原因之一。SGK3在生殖系統(tǒng)中的作用值得進(jìn)一步調(diào)查。

應(yīng)用案例2

研究人員使用全基因組甲基化芯片聯(lián)合生物信息學(xué)方法來鑒定自身性免疫性疾病GD的差異甲基化區(qū)（DMR），通過構(gòu)建DMR注釋基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）篩選出關(guān)鍵節(jié)點基因（Hub Gene）。利用翼和生物Hi-MetylSeq技術(shù)分析了關(guān)鍵節(jié)點基因的DMR區(qū)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CDKN2C、SERPINA1、IRS4，尤其是B3GNT2是潛在的與GD相關(guān)的異常甲基化基因。這些發(fā)現(xiàn)可能是GD疾病中的DNA甲基化的近報道。

綜上所述，全基因組甲基化測序分析獲得DMR后，需要在隊列樣本中進(jìn)行驗證，翼和Hi-MethylSeq技術(shù)是WGBS后續(xù)驗證的有力工具。

主要參考文獻(xiàn)：Cai et al. Identifying and validating differentially methylated regions in newly diagnosed patients with Graves' Disease. DNA and Cell Biology 2021, 40(3):1-9.

Zhou et al. Genome wide methylation analysis to uncover genes related to recurrent pregnancy loss. Genes & Genomics 2021, 43(4):361-369.