--細 胞 基 本 信 息---

細胞名稱： LLC(小鼠肺癌細胞)

細胞別稱： LL/2 (LLC1); LL/2 (LLc1); LL/2(LLc1); LL/2; LL2; LLC1; LLC; Lewis lung carcinoma line 1; Lewis lung carcinoma; Lewis-Lung; Lewis Lung

細胞貨號： SNL-119

生長特性： 貼壁

培養(yǎng)條件： DMEM+10% FBS+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境： 空氣，95%； 二氧化碳 (CO2)，5%；37℃

細胞簡介： LLC細胞是一種從C57BL小鼠的肺中建立的細胞系，該小鼠攜帶由原發(fā)性Lewis肝癌植入引起的腫瘤。LLC細胞對1, 3-雙-（2-氯乙基）-1-亞硝ji脲有抗性，但對甲氨蝶呤敏感。據(jù)報道，LLC細胞具有高度致瘤性，可以在C57BL小鼠成瘤，但在小鼠中轉(zhuǎn)移性較弱。LLC細胞在培養(yǎng)瓶中形成多層，但實際上沒有融合。LLC細胞鼠痘病毒陰性，被廣泛用作轉(zhuǎn)移模型，并有助于研究癌癥化療藥物的機制。

細胞正常生長形態(tài)照片

LLC細胞培養(yǎng)注意事項：

1. 形態(tài)多樣

LLC細胞形態(tài)不均一，上皮樣細胞與圓形細胞同時存在，比例不定，兩種形態(tài)的細胞皆為貼壁狀態(tài)?？赡艽嬖谏倭科〖毎?dāng)貼壁細胞較多時，漂浮細胞可以舍棄。當(dāng)漂浮細胞較多時，可在換液時離心收集并接種回原瓶。

2. 細胞生長較快

培養(yǎng)時應(yīng)加入足量的培養(yǎng)基，避免培養(yǎng)基營養(yǎng)快速耗盡導(dǎo)致細胞脫落或狀態(tài)變差。注意關(guān)注培養(yǎng)基顏色變化和細胞密度，培養(yǎng)基變黃后及時換液，細胞密度到達80%后及時傳代。

3. 密度較高時易堆疊生長

注意控制細胞密度不要過高，長期高密度培養(yǎng)易導(dǎo)致細胞堆疊生長或細胞聚團。

4. 對血清要求高

LLC細胞對血清質(zhì)量較為敏感，需要使用高質(zhì)量胎牛血清進行培養(yǎng)。若培養(yǎng)中途更換血清品牌，細胞需要經(jīng)歷一個過渡期。（若需更換血清品牌，建議先使用廠家配套的完quan培養(yǎng)基進行培養(yǎng)并保種，再更換新品牌血清配制的培養(yǎng)基進行測試培養(yǎng)，避免細胞因不適應(yīng)新血清而損失細胞）

5. 細胞貼壁較弱

該細胞貼壁比較弱，消化時間偏短，注意控制消化時間（消化步驟見下文傳代攻略）

。

另外，在遇到快遞運輸震蕩、低溫、室溫靜置太長時間、添加的培養(yǎng)基或其他試劑過冷等情況時會出現(xiàn)明顯的細胞回縮變粗變短甚至脫落的現(xiàn)象，及時放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)后可恢復(fù)正常。

平時注意傳代換液前將培養(yǎng)基、PBS等試劑充分預(yù)熱，不要把細胞放在室溫下太長時間。采用T25瓶發(fā)貨，收貨時可能出現(xiàn)部分細胞漂浮，正確處理后細胞可正常生長（處理方法見下文收貨攻略）

LLC細胞傳代攻略

1. 準備所需的培養(yǎng)基、胰酶、PBS、離心管、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等；（試劑提前預(yù)熱）

2. 先盡量吸干凈T25瓶原培養(yǎng)基，再加5mL 常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20s，吸走潤洗的PBS；

3. T25瓶加1mL胰酶，輕輕晃動培養(yǎng)瓶以使胰酶鋪勻瓶底細胞層，將培養(yǎng)瓶放入37度培養(yǎng)箱消化；

4. 消化到細胞明顯回縮，間隙變大，但未完quan脫落時加2-3mL完quan培養(yǎng)基終止胰酶消化；

Tips：

如果您無法準確掌控胰酶作用時間，建議按照下述操作：加入胰酶后，放入37度培養(yǎng)箱消化，然后每隔30秒拿出觀察，若細胞部分滑落，說明消化完成可以終止消化，否則再放回培養(yǎng)箱消化30秒重復(fù)操作；細胞貼壁較弱，所以消化時間會比常規(guī)貼壁細胞短很多，注意控制消化時間；

5. 混勻細胞并轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心3min；

6. 在新的培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；（T25推薦10mL，T75推薦20mL）

7. 離心完成后，棄上清，加入適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸吹散細胞，將細胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中，十字法或8字法混勻，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，注意培養(yǎng)瓶蓋透氣；

Tips：

1. 推薦傳代比例1：2，細胞生長至80%密度時立即傳代。

2. 建議傳代后24h觀察細胞，若有漂浮死細胞，可通過換液去除（換液前培養(yǎng)基預(yù)熱）

LLC細胞凍存攻略

1. 配制程序性凍存液，準備相應(yīng)數(shù)量凍存管并做好標記。

Tips：推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完quan培養(yǎng)基+8%DMSO

2. 先將細胞按傳代步驟獲得細胞沉淀；

3. 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細胞，并將細胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中；

4. 將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；

5. 轉(zhuǎn)移凍存細胞至液氮保存并登記細胞保存位置。

Tips：

l 液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測凍存細胞的活性，若活性合格即可長期保存。

l 程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液請按產(chǎn)品說明書處理降溫過程。

l T25培養(yǎng)瓶長滿通?？蓛龃?-3管，10cm皿長滿通常可凍存3-4管。

l 凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細胞狀態(tài)不佳。

LLC細胞復(fù)蘇方法

1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃，培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃，離心機設(shè)置好轉(zhuǎn)速；

2. 將細胞從液氮罐中取出，觀察管內(nèi)無液氮的情況下，捏住管蓋，將細胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃，細胞融化至米粒大小冰塊時終止水浴，融化過程不超過2min；

Tips：

l 若液氮或冰箱距離細胞房較遠，細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。

l 凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細胞時震動不要過大。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮，若有液氮需靜置一會待液氮完quan蒸發(fā)后再水浴。做好防護，避免凍存管炸開導(dǎo)致受傷。

l 水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染。

3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min，不同離心機具體轉(zhuǎn)速會有差異

4. 離心完成后棄上清，用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管，輕柔重懸細胞后接種至培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱；

5. 復(fù)蘇24小時后觀察細胞貼壁情況。

Tips：整個細胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。

LLC細胞收貨攻略

l 常溫細胞

1. 收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上；

2. 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL，顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片，觀察細胞密度，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（首ci傳代比例建議1：2），若細胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度80%以上再進行傳代培養(yǎng)；

Tips：若收貨時細胞發(fā)生脫落漂浮，請按以下步驟處理：

1. 先放培養(yǎng)箱靜置4h，所有培養(yǎng)基（1200rpm，5min）離心收集漂浮細胞。

2. 離心完，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管后續(xù)可用于培養(yǎng)細胞。用1mL 0.25%胰酶（含EDTA）輕輕吹起細胞沉淀（不要反復(fù)吹打），室溫靜置30s后加3mL完培中和胰酶，離心去上清，用新鮮完培重懸混勻細胞。

3. 同時，貼壁細胞用預(yù)熱的PBS輕輕潤洗后加1mL胰酶（勿沖洗），放37度培養(yǎng)箱消化1min，加3mL完培中和胰酶，離心去上清，用新鮮完培重懸混勻細胞。

4.  第2、3步收集的細胞合并起來，均勻接種到2個新的T25培養(yǎng)瓶(或6cm皿)中。24h后觀察細胞狀態(tài)。

l 凍存細胞

1. 細胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復(fù)蘇）短期保存或液氮中長期保存，若干冰完quan揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細胞并聯(lián)系銷售人員解決；

2. 凍存細胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查，以免超出售后期，復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略；

3. 復(fù)蘇一管細胞出現(xiàn)異常及時聯(lián)系銷售人員，在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進行下一步操作；

Tips：

1. 細胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完quan揮發(fā)等異常情況時，及時拍照聯(lián)系銷售人員；

2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內(nèi)含對應(yīng)細胞的完quan培養(yǎng)基，可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續(xù)細胞培養(yǎng)；

常見問題及解決方案

細胞密度怎么計算的？

嚴格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數(shù)細胞數(shù)量，但在實際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細胞數(shù)量而消化細胞計數(shù)。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當(dāng)然這種表達方式受限于單個細胞生長不同密度時所占面積不同導(dǎo)致并不嚴謹，但也是相當(dāng)直觀、簡便的表現(xiàn)細胞狀態(tài)的一種方式；

NO.2培養(yǎng)過程中細胞碎片較多怎么處理？

1. 細胞內(nèi)的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現(xiàn)象，只是不同細胞顆粒多少有區(qū)別，細胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。

2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物，可通過換液去除，因此每2天正常換液即可，換液前培養(yǎng)基充分預(yù)熱。

NO.3細胞具體消化時間是多久？

每個客戶用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能完quan規(guī)定消化時間，以實際消化效果和客戶經(jīng)驗為準。 

產(chǎn)品推薦：

【SNL-119】LLC(小鼠肺癌細胞)

【SNLM-119】LLC細胞專用完quan培養(yǎng)基