益生菌是一種有益于人體健康的微生物，常被用于改善腸道菌群。微膠囊包埋技術(shù)可以幫助保護(hù)菌株，延長其在體內(nèi)的存活時間，不易受外界環(huán)境的影響而失活。因此，在生產(chǎn)益生菌產(chǎn)品時，需要考慮選擇合適的微膠囊技術(shù)，以確保益生菌的穩(wěn)定性和活性。下面這篇應(yīng)用非常好的結(jié)合了微膠囊包埋和冷凍干燥技術(shù)，證明菌種經(jīng)過包埋干燥后仍具有生物活性，為發(fā)酵工藝和食品轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域開辟新的可能性。

介紹

冷凍干燥，也稱為凍干是一種非常通用的脫水方法，常用于保存微生物、食物或藥物，如蛋白質(zhì)類藥物。它將冷凍和干燥結(jié)合在一個特別的操作中，可以創(chuàng)造出高質(zhì)量的干燥終產(chǎn)品。

冷凍干燥通常用于保存微生物培養(yǎng)物，因為它具有不可忽視的優(yōu)點：儲存的方便性和增加郵寄微生物的可能性。此外，制得的產(chǎn)品只需要少量維護(hù)，培養(yǎng)基在儲存過程中不會受到污染，微生物可以長時間保持活力。

然而，冷凍干燥技術(shù)對微生物至關(guān)重要，因為它對微生物的生存能力和生理狀態(tài)都有負(fù)面影響。根據(jù)方法和生物體的不同，微生物存活率也各有不同；然而，活力水平明顯低于液氮儲存 ²。觀察到的活力下降主要是由于一些不良副作用引起的，例如細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成¹、敏感蛋白的變性或在此過程中膜脂質(zhì)的物理狀態(tài)發(fā)生一些不可逆的變化 ^3,5。為了防止這種影響，通常在冷凍或冷凍干燥前使用脫脂牛奶、蔗糖、甘油、 DMSO 或海藻糖等作為凍干保護(hù)物質(zhì)^1,3。

據(jù)報道，海藻糖在干燥、冷凍、滲透脅迫和熱休克等非常環(huán)境下對酵母和細(xì)菌具有保護(hù)作用。這些保護(hù)效果與膜的穩(wěn)定和酶活性的保存有關(guān)。關(guān)于海藻糖的保護(hù)作用，已經(jīng)報道了幾種假設(shè)。一些報道認(rèn)為它的作用是通過多個外部氫鍵取代參與維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的水分子，另一些報道認(rèn)為它形成玻璃態(tài)結(jié)構(gòu)以確保物理穩(wěn)定性。

除了發(fā)酵過程或食品轉(zhuǎn)化，釀酒酵母或乳酸菌等微生物在益生菌膳食食品和飼料補充劑領(lǐng)域具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。然而，這些應(yīng)用需要在儲存過程中保持細(xì)胞活力。通過造粒和冷凍干燥技術(shù)相結(jié)合，可以得到大小和組成均勻的無塵顆粒。由于具有更高的顆粒表面積，這使得產(chǎn)品將具有良好的顆粒流動性，更容易掌握的劑量和更快的產(chǎn)品復(fù)原性。盡管存在上述挑戰(zhàn)，冷凍干燥仍然是一種酵母、孢子真菌和細(xì)菌的方便保存方法，因為它們的長期生存能力通常保持得相當(dāng)好，而且菌株的儲存和分發(fā)要求也很簡單。

因此，本應(yīng)用旨在生產(chǎn)釀酒酵母顆粒作為模型微生物，使用微膠囊造粒儀 Encapsulator B-390 作為造粒機，將酵母懸浮液擠壓進(jìn)入液氮中形成單分散球體，然后使用冷凍干燥機 Lyovapor™ L – 200 進(jìn)行冷凍干燥處理。

儀器，試劑和器材

儀器：

• ESCO NordicSafe, Biosafety Cabinet Class II

• BUCHI 微膠囊造粒儀 Encapsulator B-390

• BUCHI 冷凍干燥機 Lyovapor^TM L-200 Pro，干燥腔體搭配可加熱擱板

• BUCHI Lyovapor^TM Software

試劑：

• YPD 培養(yǎng)基, Sigma Aldrich

• 海藻糖, Sigma Aldrich

• 脫脂奶粉

• 瓊脂

• 去離子水

• 液氮

器材：

• 玻璃培養(yǎng)皿

• 液氮杜瓦瓶

實驗

本應(yīng)用中描述的工作是在無菌條件下進(jìn)行的。將 84g 市售面包酵母懸浮溶解在 50mL 無菌 YPD 培養(yǎng)基(Sigma Aldrich)中。在酵母懸浮液中加入 50mL 無菌凍干保護(hù)劑培養(yǎng)基（5g 海藻糖(Sigma Aldrich)和 5g 脫脂牛奶溶于去離子水中），然后用微膠囊造粒儀 B-390 進(jìn)行制粒(表1)。將擠壓后的液滴收集在液氮浴中冷凍，然后轉(zhuǎn)移到不銹鋼托盤中，保存在 -25°C 的冰箱中進(jìn)行冷凍干燥。

表1：微膠囊包埋參數(shù)

冷凍干燥步驟(初級干燥和次級干燥)使用 Lyovapor^TM 編程軟件，如表 2 所示。使用 Lyovapor^TM L-200 Pro 干燥腔體、可加熱的擱板和環(huán)境空氣。

表2：初級干燥和次級干燥凍干參數(shù)

無酵母菌微球采用與含酵母菌微球相同成分培養(yǎng)基和參數(shù)進(jìn)行制備。

冷凍干燥后，將 1mL 無菌水加入 1mL 微球中，用以復(fù)原樣品。對于含有酵母菌的菌珠，對每個重組溶液進(jìn)行10倍、100 倍和 1000 倍的連續(xù)稀釋。將復(fù)原后的溶液和稀釋液分別涂于 YPD 瓊脂平板上，如圖 1 所示。瓊脂板在 28℃ 培養(yǎng) 24h，評價細(xì)胞活力。

結(jié)果與討論

含有酵母的微球可以通過使用微膠囊造粒儀 B-390 進(jìn)行包埋制備，結(jié)果表明:用微膠囊造粒儀 B-390 將酵母滴入液氮中，可使酵母迅速顆?；?；用 300μm 的噴嘴和 1mm 的噴嘴分別制備了 700μm 和 1500μm 左右的微球。僅使用含凍干保護(hù)劑介質(zhì)的溶液也得到了類似的結(jié)果。如圖 2 所示，凍干后的微球在形狀和大小上與濕凍微球保持相似。

通過掃描電鏡對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。在圖 3 中，可以觀察到含有酵母的球珠(下兩圖)和僅由凍干保護(hù)劑培養(yǎng)基制成的球珠（上兩圖）在形態(tài)上的差異。含有酵母菌的微球具有由 5μm 顆粒組成的粗糙結(jié)構(gòu)，可以認(rèn)為是微生物，而只含有凍干保護(hù)劑的微球具有更光滑的結(jié)構(gòu)。

當(dāng)冷凍干燥時，考慮到膜中脂質(zhì)物理狀態(tài)的變化或由于某些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，生物系統(tǒng)可能受到破壞^3,9。為了驗證酵母菌的活力，將酵母菌重新水合，稀釋，并在 28°C 的 YPD 瓊脂板上培養(yǎng) 24 小時。圖 4 證實了文獻(xiàn)報道的內(nèi)容，即便失去了部分活力，酵母在凍干后仍然可以生長^2,4,6,10。

結(jié)論

含有酵母菌的微?？梢院苋菀椎赜梦⒛z囊造粒儀 B-390 進(jìn)行制備，并使用凍干機 Lyovapor^TM L-200 進(jìn)行冷凍干燥處理。B-390 的噴嘴直徑分別為300 μm和1000 μm，制得的微粒直徑分別為 700μm 和 1500μm。冷凍干燥后，珠粒的大小和形狀沒有變化。該顆粒流動性好，容易掌握使用劑量，且與水混合后溶解速度快。凍干后的微生物在貯藏過程中仍能保持良好的活力，并能在復(fù)水化后成功生長。

在本應(yīng)用中，造粒包埋和冷凍干燥的結(jié)合顯示出了非常好的實驗結(jié)果。它可以在發(fā)酵工藝和食品轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域開辟新的可能性，有利于生產(chǎn)制備劑量易控制和重組的培養(yǎng)發(fā)酵劑；另外，在益生菌和食品補充劑領(lǐng)域中獲得無塵且可自由流動的粉末，同時保證產(chǎn)品顆粒大小和組成的均勻度。

參考文獻(xiàn)