局部氧梯度存在于所有組織中，無論是天然的還是工程的。組織氧合影響細(xì)胞遷移、增殖和分化。缺氧環(huán)境對于某些發(fā)育過程是必要的，例如胚胎和成體干細(xì)胞需要特定的氧張力來維持其多能性、分化或維持其分化。然而，缺氧微環(huán)境也是癌癥組織的共同特征，因為它們的新陳代謝上調(diào)。多細(xì)胞腫瘤球體 （MCTS） 被認(rèn)為是使用體內(nèi)或體外腫瘤材料的有用體外替代方案。它們是研究抗癌藥物效果的有力工具，因為它們代表了 2D 單層細(xì)胞和常規(guī)組織結(jié)構(gòu)之間的中間體。了解球狀體及其不同區(qū)域（增殖區(qū)、靜止區(qū)、壞死區(qū)）內(nèi)的氧合狀態(tài)對腫瘤研究至關(guān)重要。例如，中央球狀體區(qū)域缺氧會導(dǎo)致核心靜止或壞死。氧合狀態(tài)可作為抗癌藥物療效的指標(biāo)，有助于識別和選擇合適的個性化藥物。關(guān)于活體 3D 細(xì)胞培養(yǎng)物中的時間和空間分辨氧合和缺氧的信息仍然缺乏適當(dāng)?shù)纳锵嗳菪詼y量技術(shù)。在這里，我們提出了一種技術(shù)，該技術(shù)允許在較長時間的生長條件下對3D細(xì)胞培養(yǎng)模型進(jìn)行空間和時間分辨監(jiān)測。它可以在正常培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行自動、非侵入性測量，并提供 2D 橫截面氧分布。

材料與方法

    使用二維氧成像系統(tǒng)VisiSens TD（PreSens，Regensburg，Germany）記錄時空梯度，該系統(tǒng)帶有一個特殊的顯微成像附件，該附件由顯微鏡鏡頭和適配激發(fā)光源（VisiSens TD MIC Kit）組成。SF-RPSu4氧傳感器箔（PreSens，Regensburg，Germany）用于定量局部O2濃度。使用VisiSens ScientifiCal軟件進(jìn)行單圖像2D映射或時間序列圖像采集以及圖像評估。傳感器在37 °C下使用0 %和100 %空氣飽和介質(zhì)進(jìn)行兩點校準(zhǔn)。

   O的碎片2用硅膠（SG-1型）將傳感器箔（生長面積為0.385 cm2）粘在直徑為3.5 cm的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)皿的底部。白色光學(xué)隔離層從傳感器箔上剝離。用氬等離子體處理具有集成傳感器的培養(yǎng)皿 1 分鐘，并用 150 μl 胎牛血清 （FCS） 包被氧敏箔以支持細(xì)胞粘附。在傳感箔周圍放置一個直徑為 0.7 cm 的圓形 PDMS 腔室，以簡化球體的播種并在附著階段將其保持在適當(dāng)?shù)奈恢谩Ｔ谘鮽鞲衅鞑瓍^(qū)域加入100μl含有單個3D培養(yǎng)球體（起始細(xì)胞數(shù)3000;直徑約500μm）的MCF-7培養(yǎng)基。培養(yǎng)皿的周圍區(qū)域被MCF-7培養(yǎng)基淹沒，以防止樣品變干。將球狀體附著在氧敏感基質(zhì)表面24小時（37°C，5%CO2).

    圖1：采用MIC配置的VisiSens TD氧氣成像系統(tǒng)圖像（左）。小型化允許將檢測器和激發(fā)單元集成到標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中。傳感器箔粘在細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)皿的底部，培養(yǎng)皿可以放置在讀出單元的樣品架上。MCF-7 球體在粘附在傳感器箔片上時形成半球形結(jié)構(gòu)（右）。生物相容性氧敏箔由成像系統(tǒng)的 LED 激發(fā)，發(fā)射由靈敏相機(jī)映射。自動測量由VisiSens ScientifiCal軟件控制。