細(xì)胞因子多為多肽、蛋白或者糖蛋白,具備良好的抗原性,利用免疫學(xué)技術(shù)可以方便獲得不同細(xì)胞因子的抗血清、多克隆抗體或者單克隆抗體。細(xì)胞因子檢測無論是對免疫學(xué)、分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究,還是對闡明某些疾病的發(fā)病機(jī)理,指導(dǎo)臨床治療均具有重要的意義。免疫學(xué)檢測法是細(xì)胞因子檢測常用的方法之一。
資料表明細(xì)胞因子與疾病的病理過程密切相關(guān),細(xì)胞因子檢測及其基因表達(dá)狀況的測定正呈上升之勢。美迪西不僅可以為客戶提供基于Bio-Plex 200、流式CBA、MSD、Luminex系統(tǒng)等全面進(jìn)行各種single plex或multiplex的細(xì)胞因子檢測,還建立了一系列相關(guān)的免疫學(xué)檢測平臺,用于細(xì)胞因子的檢測。
1、細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附法ELISA檢測法
酶聯(lián)免疫吸附法ELISA是一種特殊的試劑分析方法,它是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù),其試劑易于保存、結(jié)果判斷較為客觀,是目前實驗室檢測抗原抗體經(jīng)濟(jì)、普遍的試驗診斷方法。ELISA法適用于測定細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、血漿及組織液中的樣本,干擾小可以測到每毫升納克水平的細(xì)胞因子的水平。
ELISA基本原理是:
1)使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性。
2)使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體,這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。由于酶的催化頻率很高,故可放大反應(yīng)效果,從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。
3)在測定時,將待測抗體(抗原)、酶標(biāo)抗原(抗體)與固相抗原(抗體)結(jié)合形成免疫復(fù)合物,經(jīng)洗滌使免疫復(fù)合物與待測抗體(抗原)呈比例,加入酶反應(yīng)物使其與固相上的酶反應(yīng)比那的,根據(jù)顏色做定性或定量分析,得出檢測結(jié)果。
2、細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)檢測法
酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)檢測法是基于定量夾心ELISA法原理,將刺激后的細(xì)胞滴加到包被在貼PVDF微孔中,放置于37℃孵育。在孵育的過程中,細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子即會被包被的抗體所捕獲,最后用不溶性的酶聯(lián)底物進(jìn)行顯色,每一個顯色點(斑點)代表一個分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞。通過專用的ELISPOT分析儀或在顯微鏡下進(jìn)行計數(shù),就可以進(jìn)行分析。
ELISPOT法可以在單細(xì)胞水平對細(xì)胞因子(CK)分泌細(xì)胞進(jìn)行檢測。由于是單細(xì)胞檢測,ELISPOT比ELISA具有更高的靈敏性,能從20萬—30萬細(xì)胞中檢出1個分泌該蛋白的細(xì)胞。并且該方法綜合了普通ELISA方法的高特異性和準(zhǔn)確定量的優(yōu)點,而且具有生物活性分析得出與功能相關(guān)的結(jié)果的優(yōu)點。
3、細(xì)胞因子雙抗夾心ELISA檢測法
雙抗體夾心法需制備針對細(xì)胞因子不同位點的兩個單克隆抗體,先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上,用于捕獲抗原,再用酶標(biāo)的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,加入酶反應(yīng)底物,測定產(chǎn)物的吸光值,計算出捕獲的抗原量。
該方法可用于抗原檢測,例如細(xì)胞因子、激素、蛋白質(zhì)、細(xì)菌和病毒等,是目前檢測抗原常用的ELISA方法。
4、細(xì)胞因子免疫印跡法Western Blot檢測法
Western Blot是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞或者組織樣本中的蛋白,經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后目標(biāo)蛋白與te有性一抗結(jié)合,再與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過底物顯色,分析曝光條帶的位置和灰度分析獲知目標(biāo)蛋白在樣本中的表達(dá)情況。
Western Blot法結(jié)合了凝膠電泳和固相免疫測定兩種技術(shù)的高特異性和高敏感性,可以對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定型和半定量的分析。通過抗原抗體反應(yīng)對目標(biāo)蛋白的表達(dá)進(jìn)行半定量檢測,還可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后續(xù)分析。WB作為一種方便可靠的研究工具,將與譜和蛋白質(zhì)芯片等技術(shù)一起在蛋白質(zhì)組時代發(fā)揮重要作用。由于細(xì)胞因子分子量比較小,有些用Western Blot進(jìn)行檢測不合適。
免疫學(xué)檢測法的主要特點是基于抗原抗體反應(yīng),反應(yīng)簡單、快速,實驗重復(fù)性好,大量商業(yè)化試劑盒也都是基于這種檢測方法。但是,由于僅僅基于分子間免疫學(xué)反應(yīng),所測得細(xì)胞因子含量,并非等同于具備生物學(xué)活性的折疊正確的細(xì)胞因子,所以,在很多情況下需要借助于生物學(xué)檢測法最終確定細(xì)胞因子生物學(xué)活性。
細(xì)胞因子作為臨床和基礎(chǔ)研究的重要生物學(xué)分子和檢測指標(biāo),其生物活性測定方法選擇的核心依據(jù)是該細(xì)胞因子與特定靶細(xì)胞在特定培養(yǎng)條件下的反應(yīng)性。結(jié)合免疫學(xué)方法對細(xì)胞因子含量的初步分析,并通過選取適當(dāng)?shù)捏w外細(xì)胞培養(yǎng)模型,我們才能獲得相對準(zhǔn)確的細(xì)胞因子的生物學(xué)活性指標(biāo)。
5、細(xì)胞因子免疫學(xué)檢驗法常見問題總結(jié):
(1)ELISA 試 劑 盒 主 要 有 哪 些 試 劑 ?
ELISA 試劑盒中主要有
1)已包被抗原或抗體的固相載體(免疫吸附劑);
2)酶標(biāo)記的抗原或抗體(結(jié)合物);
3)酶的底物;
4)標(biāo)準(zhǔn)品;
5)結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液;
6)洗滌液;
7)酶反應(yīng)終止液。
(2)造成ELISA測定結(jié)果不正常的因素主要有:
1)標(biāo)本因素:樣本需新鮮采集,防止污染,且準(zhǔn)確稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)。
2)試劑因素:ELISA試劑盒在保質(zhì)期內(nèi),其他試劑如蒸餾水的水質(zhì)等。
3)操作因素:注意操作細(xì)節(jié),如加樣不可太快,避免加在孔壁上;洗板過程中注意洗液不能溢出孔外;顯色要注意控制時間等。
(3)ELISA 試劑盒(96 孔規(guī)格)一般可以進(jìn)行多少個樣本的檢測?
標(biāo)準(zhǔn)品孔和待測樣本孔需進(jìn)行復(fù)孔操作以保證數(shù)據(jù)的可信度。每次需將標(biāo)準(zhǔn)品按照7-8個梯度稀釋以制備準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)曲線。一次96孔板實驗可以進(jìn)行20-25個樣本的檢測工作。
(4)抗體使用有哪些注意事項?
使用抗體前需仔細(xì)閱讀說明書,了解抗體的保存條件以及不同用途下的推薦稀釋比例。較高濃度的抗體(>0.5mg/mL)通常性質(zhì)更穩(wěn)定,受生產(chǎn)工藝和成本控制等因素影響,不同品牌的抗體的濃度也不相同,所以購買時應(yīng)注意比較,經(jīng)驗不足的實驗者往往被抗體的體積迷惑,要注意相同質(zhì)量下低濃度的抗體體積反而更大。
(5)什么是WB的灰度半定量分析?
通常用Image J 或photoshop軟件對各個樣本的目的蛋白及其內(nèi)參蛋白曝光后膠片的灰度值進(jìn)行計算,按照灰度值的高低來半定量分析各個樣品中蛋白的表達(dá)差異。
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