透射電鏡常用的50-100 kV電子束來說，樣品的厚度控制在10～100 nm為宜。由于電鏡產(chǎn)生的電子束穿透能力很弱，需要把標本切成厚度小于0.1 µm以下的薄片才適用，這種薄片稱為超薄切片(Ultrathin sectioning)。常用的超薄切片厚度是50-70 nm，也可進行冷凍超薄切片。

超薄切片技術是為透射電子顯微鏡觀察提供薄樣品的專門技術，研究材料類、生物類樣品的基本技術，尤其是觀察細胞、組織、器官等的超微結構以及亞細胞結構常用的技術。也是電鏡細胞化學、免疫電鏡等技術的關鍵性技術。它在生物學的發(fā)展過程中占據(jù)重要的地位，目前各種細胞、組織的超微結構知識幾乎都是由它提供的。

冷凍超薄切片機 Leica EM UC7

取材→固定→脫水→包埋（滲透、包埋、聚合）→超薄切片→電子染色（生物類）

取材→清洗→包埋（滲透、包埋、聚合）→超薄切片→電子染色（材料類）

生物樣品超薄切片要求：

（2）切片厚度50-100 nm為宜：太薄反差低；太厚反差好，但結構重疊，電子束不能穿透；

（3）切片應耐電子束的強烈照射，不變形不升華；

（4）切片能夠適當被染色，保證一定的反差；

（5）切片均勻，無皺褶、刀痕，無染色劑或其他化學物質的沉淀。

目地和要求

（1）新鮮。(材料離體后1-5 min內進入固定液，避免細胞自溶和結構變化)

（2）體積小。(厚度<1 mm，長度寬度均<5 mm，固定液滲透能力有限，組織太大會導致無法固定充分）

（3）機械損傷小。(動作輕巧，器械鋒利，避免對組織的擠壓和推拉，建議用剃須刀片、手術刀片、手術剪刀。)

（4）低溫操作，器械、容器、固定液均需預冷（降低酶的活性，減少組織自溶）。

（5）取材部位準確，且注意材料的方向性和定位。

目的和要求：終止組織細胞的生化過程同時把它們的超微結構改變控制在最小范圍內，并保護這些結構在后續(xù)的脫水、包埋等過程中不被破壞；將蛋白、離子等內容物保留在原位，以便后續(xù)的研究。

（1）破壞細胞的酶活性系統(tǒng)

（2）穩(wěn)定細胞物質成分，并保存之

（3）接近細胞生活狀態(tài)的滲透壓,使細胞不收縮或膨脹

（4）在組分的分子之間建立交聯(lián)，提供骨架穩(wěn)定細胞器的空間構型

（5）提供一定的電子反差

戊二醛（C5H8O2)：滲透性好，保存蛋白質、酶活性，穩(wěn)定糖元，無電子染色作用，固定脂類和膜差?？砷L時固定（低溫可達半年）。

鋨酸（OsO4)：強氧化劑，固定脂類、膜結構，有電子染色作用；破壞酶活性。

多聚甲醛：優(yōu)良地保存酶活性，用于細胞化學。

緩沖液：仿效細胞外液成分，對細胞富有生理保護。維持穩(wěn)定的pH值；提供適當?shù)臐B透壓；提供適當?shù)碾x子成分使樣品不抽提，不沉淀。

    1.pH值：動物組織7.2-7.4，植物6.8-7.0，高度含水組織8.0-8.4

    2.緩沖液類型：磷酸緩沖液、緩沖液等，0.05-0.1 mol/L

    3.滲透壓：KCl, NaCl, 蔗糖調節(jié)

    4.固定劑濃度：戊二醛2-6%等

    5.材料大?。?.5-1 mm3

操作步驟：

戊二醛固定液：有細胞壁的樣品5%，無細胞壁樣品3%。加入緩沖體系，確保生物樣本內外滲透壓，避免細胞縮小或吸漲。

30％→50％→70％→80％→90％→95％(以上步驟每次15-20 min)→100％(2-3次，每次15 min)→100％丙酮(20 min) 

常用Epon 812、Spurr、LR white等

可手工、機械修塊。

醋酸鈾：主要染核酸、核蛋白、細胞核、結締組織。要避光，有微弱的放射性

檸檬酸鉛：主要染膜結構、脂類、核酸。易與CO2反應成沉淀，染色中應避免。

步驟：單染：鉛鹽單染,鈾鹽單染。