Santa Cruz公司產(chǎn)品Protocols及相關(guān)支持產(chǎn)品

Santa Cruz生物技術(shù)公司為*抗體提供了高品質(zhì)的支持產(chǎn)品。包括用于WB和IHC的自產(chǎn)的第二抗體， 用于IP研究的發(fā)光試劑，瓊脂糖標(biāo)記proteinA，proteinG PLUS和proteinL，用于WB的胞核提取，全細(xì)胞溶解物，組織提取試劑，WB膜，TransCruz凝膠遷移寡核苷酸，封閉物和實驗室常用試劑。 提供用于WB的Cruz MarkerTM分子量標(biāo)準(zhǔn)和預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)。ImmunoCruz染色系統(tǒng)用于IHC（石蠟切片）染色，為預(yù)稀釋，即用系統(tǒng)。還介紹一系列凋亡檢測試劑 盒。支持產(chǎn)品主要涵蓋以下方面：1）WB 2）IP 3）IP/WB 4）免疫復(fù)合蛋白激酶檢測 5）免疫過氧化物酶細(xì)胞染色 6）免疫熒光細(xì)胞染色 7）流式細(xì)胞技術(shù)（FCM）8）ELISA檢測 9）TransCruz凝膠超遷移實驗 10）用多肽中和抗體活性的方法 11）染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗 12）siRNA轉(zhuǎn)染 13）半定量RT-PCR 14）溶液配制。

1. WB

A.樣品準(zhǔn)備
注意：細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品包括經(jīng)典和特殊培養(yǎng)基，血清，培養(yǎng)基添加物，誘導(dǎo)物，抗生素。產(chǎn)品列表請登陸www.scbt.com。

單層細(xì)胞

室溫下，移去培養(yǎng)基并用PBS沖洗直徑100mm的培養(yǎng)皿。以下步驟均在冰上或4℃操作，使用冰預(yù)冷的新鮮緩沖液。
加入0.6ml RIPA裂解液（sc-24948）。4℃輕輕晃動細(xì)胞培養(yǎng)皿15min。用細(xì)胞刮將貼壁細(xì)胞刮下。轉(zhuǎn)移裂解液至微量離心管內(nèi)。

用0.3ml RIPA裂解液洗一次培養(yǎng)皿，將洗液與之前的溶解物合并。（可選擇：加入10μl 10mg/ml PMSF（sc-3597）儲存液和/或用21號注射器針頭切割DNA）冰上孵育30-60min。
將細(xì)胞溶解物4℃離心，10000×g，10min。轉(zhuǎn)移漢細(xì)胞裂解物的上清至新的離心管內(nèi)，棄沉淀。

注意：涉及磷酸化作用研究時，可用PhosphoCruTM蛋白純化試劑盒（sc-24964）富集純化細(xì)胞溶解物中的磷酸化蛋白。

懸浮細(xì)胞
室溫低速離心5min，收集約2.0×107個細(xì)胞。小心除去培養(yǎng)基。
室溫下用PBS沖洗細(xì)胞沉淀，再次低速離心5min，小心除去培養(yǎng)基。
加入1.0ml冰預(yù)冷的RIPA裂解液（sc-24948），裂解液中現(xiàn)用現(xiàn)加入蛋白酶抑制劑和/或磷酸酶抑制劑。用移液器輕輕懸浮細(xì)胞，冰上孵育30min。
 用21號注射器針頭、杜恩斯勻漿器或超聲進(jìn)一步破壞使細(xì)胞均質(zhì)化。注意不要使裂解物溫度過高。（可選擇：加入10μl 10mg/ml PMSF（sc-3597）儲存液。）冰上孵育30min。
將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管，4℃離心，10000×g，10min。轉(zhuǎn)移上清至新的離心管內(nèi)，棄去沉淀。

注意：涉及磷酸化作用研究時，可用PhosphoCruTM蛋白純化試劑盒（sc-24964）富集純化細(xì)胞溶解物中的磷酸化蛋白。

組織樣品
稱重組織塊，并用干凈的剃刀剪碎。冰凍組織可被切的很薄，并在含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液（sc-24948）中解凍。3ml冰預(yù)冷的RIPA/g組織。
杜恩斯勻漿器或超聲進(jìn)一步破壞使細(xì)胞均質(zhì)化，溫度維持在4℃。（可選擇：加入30μl 10mg/ml PMSF（sc-3597）儲存液/g組織。）冰上孵育30min。
將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管，4℃離心，10000×g，10min。棄沉淀?？杉娱L離心時間獲得更好的裂解產(chǎn)物。

注意：涉及磷酸化作用研究時，可用PhosphoCruTM蛋白純化試劑盒（sc-24964）富集純化細(xì)胞溶解物中的磷酸化蛋白。

B電泳

將樣品（每個泳道全細(xì)胞提取物40-60μg，胞核提取物10-20μg或10-20ng純化蛋白）與等體積2×電泳上樣緩沖液（sc-24945）混合，煮沸2-3min。未用完的樣品可保存在-20℃。
上樣，10μl/1.0mm×0.75mm孔。
推薦使用Cruz MarkerTM分子量標(biāo)準(zhǔn)（sc-2035）。小膠（0.75mm）每孔上樣2μl，大膠（1.5mm）每孔上樣5μl。如用與Cruz MarkerTM一致的第二抗體，可看到用于檢測試劑的內(nèi)參條帶。也可選擇預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)（sc-2361）。
電泳步驟參考標(biāo)準(zhǔn)protocols。
根據(jù)廠家protocols，用電轉(zhuǎn)裝置將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至NC膜或PVDF膜上。

注意：Cruz Blot SystemTM提供預(yù)制好的人或小鼠全細(xì)胞提取物和核提取物，或小鼠組織提取物。

C.Immunoblotting
用Blotto（BlottoA或B；用抗牛第二抗體時建議使用BSA）封閉膜上的非特異位點，室溫孵育30-60min。也可選擇用不含Tween-20的Blotto，在封閉容器內(nèi)4℃過夜孵育。
如果使用的是磷酸化特異抗體，建議向封閉液和抗體稀釋液中加入50 mM NaF（NaF：sc-24988）抑制磷酸化酶。
封閉好的膜與*抗體（Blotto稀釋）稀釋液室溫孵育1小時。（如果是磷酸化特異抗體，要用加了50 mM NaF的Blotto稀釋液。）抗體*濃度根據(jù)滴度決定。建議起始稀釋度為0.5-2.0μg/ml。用TBST洗膜3次，5min/次。
將 膜與HRP或AP標(biāo)記的第二抗體稀釋液（Blotto稀釋）室溫孵育45min，稀釋度1:500-1:2000。如果背景過高，第二抗體需進(jìn)一步稀釋 （可達(dá)1:20000）。作ECL時，如果使用Cruz MarkerTM分子量標(biāo)準(zhǔn)（sc-2035），必須使用Cruz MarkerTM compatible secondary antibody作為可視化標(biāo)準(zhǔn)。
TBST洗膜3次，5min/次，然后TBS洗膜一次，5min。
將膜與化學(xué)發(fā)光試劑（sc-2408）孵育。如果發(fā)光化合物用于可見光檢測，必須用HRP標(biāo)記的第二抗體。

2．IP

注意：本操作步驟可用于放射性或正磷酸鹽標(biāo)記的細(xì)胞。（放射性物質(zhì)的使用及處理應(yīng)遵循適當(dāng)?shù)臈l例如OSHA和 NRC指導(dǎo)手冊。）細(xì)胞標(biāo)記必須在無待標(biāo)記氨基酸殘基或無磷酸鹽的培養(yǎng)基中進(jìn)行。建議標(biāo)記前使細(xì)胞處于適當(dāng)?shù)酿囸I狀態(tài)。孵育培養(yǎng)細(xì)胞（100mm細(xì)胞培養(yǎng) 皿上約80-90%
單層細(xì)胞匯合或培養(yǎng)瓶內(nèi)含約2-5×107個懸浮細(xì)胞）。通常，用傳代貼壁細(xì)胞或2-5×107個懸浮細(xì)胞可得到*標(biāo)記。

例如：除去培養(yǎng)基，加入含5%透析胎牛血清和100μCi/ml35S-蛋氨酸的無蛋氨酸培養(yǎng)基。37℃孵育1h。某些蛋白需延長標(biāo)記時間（18hrs）。有必要用PBS洗滌細(xì)胞除去未結(jié)合的放射物。

向單層傳代細(xì)胞中加入1-3ml冰預(yù)冷的RIPA（sc-24948），4℃孵育10min。對于懸浮細(xì)胞則向離心管中加入RIPA洗滌細(xì)胞沉淀。
用21號注射器針頭或超聲波反復(fù)裂解細(xì)胞。轉(zhuǎn)移裂解物至微量離心管中。
可選擇：用1.0ml冰預(yù)冷的RIPA沖洗細(xì)胞培養(yǎng)皿，與之前的合并處理。
4℃，10000×g離心10min。冰上轉(zhuǎn)移上清（細(xì)胞溶解液）至新的微量離心管。
預(yù)處理細(xì)胞溶解液，加入1.0μg的control IgG（與*抗體的種屬來源一致）和20μl懸浮的（25%v/v）瓊脂糖偶聯(lián)物（A蛋白-瓊脂糖，G蛋白-瓊脂糖，A/G蛋白-瓊脂糖，或L蛋白-瓊脂糖）。4℃孵育30min。
2500rpm（約1000×g），4℃離心30s。
轉(zhuǎn)移上清或約100-1000μg總細(xì)胞蛋白至微量離心管中。加入1-10μl（如0.2-2μg）*抗體（抗體濃度應(yīng)滴定測定），4℃孵育1-2hrs?；蛘?，可加入20μl*抗體瓊脂糖偶聯(lián)物，混勻，4℃孵育1hr-過夜；跳過下一步驟。
加入20μl適當(dāng)?shù)沫傊桥悸?lián)物懸浮液（A蛋白-瓊脂糖，G蛋白-瓊脂糖，A/G蛋白-瓊脂糖，或L蛋白-瓊脂糖）。蓋好管子，4℃振搖孵育1hr-過夜。
2500rpm（約1000×g），4℃離心30s，收集免疫沉淀物，小心吸棄上清。
用1.0ml RIPA裂解緩沖液或PBS輕輕洗滌沉淀2-4次，每次重復(fù)以上離心步驟。
zui后一次洗滌后，小心吸棄上清，用40μl 2×電泳上樣緩沖液（sc-24945）重懸沉淀。
樣品煮沸2-3min，上樣電泳分離免疫復(fù)合物，通過放射自顯影觀察結(jié)果。未用完的樣品可保存在-20℃。
可選擇：煮沸后，樣品可經(jīng)離心沉淀瓊脂糖顆粒，然后SDS-PAGE分析上清。

3．IP/WB

按照之前描述的WB程序準(zhǔn)備總細(xì)胞溶解物。

注意：如進(jìn)行磷酸化研究，溶解物可用Santa Cruz的PhosphoCruTM蛋白純化試劑盒（sc-24964）富集磷酸化蛋白。 

預(yù)處理全細(xì)胞溶解物（可選擇步驟），約1ml全細(xì)胞溶解物或組織提取物，加入0.25μg適當(dāng)?shù)腸ontrol IgG（與*抗體種屬來源一致）和20μl懸浮的（25%v/v）瓊脂糖偶聯(lián)物（A蛋白-瓊脂糖，G蛋白-瓊脂糖，A/G蛋白-瓊脂糖，或L蛋白-瓊脂 糖）。4℃孵育30min。
2500rpm（約1000×g），4℃離心30s。轉(zhuǎn)移上清（細(xì)胞溶解物）至干凈的微量離心管。
1ml細(xì)胞溶解物或約100-1000μg總細(xì)胞蛋白，加入10μl*抗體瓊脂糖偶聯(lián)物，混勻，4℃孵育1hr-過夜。
可 選擇：如無*抗體瓊脂糖偶聯(lián)物，1ml細(xì)胞溶解物加入1-10μl（如0.2-2μg）*抗體（抗體濃度應(yīng)滴定測定），4℃孵育1-2hrs。加入 20μl適當(dāng)?shù)沫傊桥悸?lián)物懸浮液（A蛋白-瓊脂糖，G蛋白-瓊脂糖，A/G蛋白-瓊脂糖，或L蛋白-瓊脂糖）。蓋好管子，4℃振搖孵育1hr-過夜。
2500rpm（約1000×g），4℃離心30s，收集免疫沉淀物，小心吸棄上清。
用1.0ml RIPA裂解緩沖液或PBS輕輕洗滌沉淀2-4次，每次重復(fù)以上離心步驟。
zui后一次洗滌后，小心吸棄上清，用40μl 2×電泳上樣緩沖液（sc-24945）重懸沉淀。
樣品煮沸2-3min。0.75mm×1.0mm的上樣孔上樣5-10μl。
電泳并按WB程序作免疫雜交。

注意：選擇不同的第二抗體，55kDa重鏈和27kDa輕鏈IgG，可檢測到*抗體。如果以上步驟中采用*抗體瓊脂糖偶聯(lián)物則*抗體條帶不明顯。

4．免疫復(fù)合蛋白激酶測定
從100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（單層細(xì)胞80-90%匯合）移除培養(yǎng)基，PBS洗一次。
加入1-3ml冰預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液（sc-24948），4℃孵育10min。（注意：RIPA裂解緩沖液對某些激酶效果不好。需要優(yōu)化裂解液成分來保持激酶活性。）
用21號注射器針頭反復(fù)抽吸使細(xì)胞破碎充分，轉(zhuǎn)移至15ml離心管中。
用1ml冰預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液，0.5%Triton X-100（sc-29112）沖洗培養(yǎng)皿，與原裂解液合并。
10000×g，4℃離心10min。4℃轉(zhuǎn)移上清至新的離心管內(nèi)。
轉(zhuǎn)移1.0ml細(xì)胞提取物（上清）至1.5ml離心管中。加入1-10μl（0.2-2μg）*抗體（抗體*濃度經(jīng)滴定測定），4℃孵育1hr。
加入20μl適當(dāng)?shù)沫傊桥悸?lián)物懸浮液（（A蛋白-瓊脂糖，G蛋白-瓊脂糖，A/G蛋白-瓊脂糖，或L蛋白-瓊脂糖）。蓋好蓋子，4℃振搖孵育1hr-過夜。
2500rpm（約1000×g），4℃離心5min，收集免疫沉淀復(fù)合物。小心吸棄上清。
1.0ml /次RIPA或PBS洗沉淀4次，每次重復(fù)上述離心步驟。
 20μl 適當(dāng)?shù)牡鞍准っ妇彌_液重懸沉淀（如50mM HEPES（sc-29097），0.1mM EDTA（sc-29092），0.01%BRIJ 35（sc-29087）），0.1mg/ml BSA，0.1% β-巰基乙醇（sc-29086），0.15M NaCl（sc-29108）。緩沖液成分根據(jù)所研究的激酶調(diào)整。
加入10-1000ng多肽底物。該底物/酶/細(xì)胞系的多肽底物濃度應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗決定。
準(zhǔn)備1ml ATP混合物：930μl適當(dāng)?shù)牡鞍准っ妇彌_液，6μl 50mM ATP，pH7.0，20μl 2.0 M MgCl2和44μl [γ32P]-ATP[10mCi/ml]。每個樣品加入10μl ATP混合物，30℃孵育30min。冰上放置。
加 入等體積2×電泳上樣緩沖液（sc-24945）終止反應(yīng)，樣品煮沸2-3min。樣品可離心沉淀瓊脂糖微珠（可選擇）；分析上清。跑SDS-PAGE， 通過放射自顯影觀察結(jié)果。未用完的樣品保存在-20℃。檢測中如用小肽底物，樣品必須通過閃爍計數(shù)或其他標(biāo)準(zhǔn)方法而不是SDS-PAGE來分析。

5．免疫過氧化物酶細(xì)胞染色

A． 組織培養(yǎng)細(xì)胞

在無菌的蓋玻片上培養(yǎng)細(xì)胞37℃過夜。PBS簡單沖洗后按以下程序之一固定細(xì)胞：
1）-10℃甲醇溶液5min，自然干燥（推薦方法）；或
2）冰丙酮2min，自然干燥；或
3）1%甲醛-PBS 10min（保持濕潤）。
PBS洗三次。
可選擇：含0.1-1%過氧化氫的PBS孵育5-10min，淬滅內(nèi)源過氧化物酶活性。PBS洗2次，5min/次。

B．冰凍組織切片

冰凍組織存放于液氮中。切片前（2周）可保存于-70℃。
95%乙醇清潔玻片，涂一薄層黏附劑，自然晾干?；蚴褂妙A(yù)處理的玻片。
切片厚度4-10μm。室溫貼片。切片保存在-70℃。固定染色前室溫解凍切片。

注意：免疫組化切片固定劑清單包括Clarion和Crystal固定劑。

冰丙酮固定切片10min，冷藏。PBS洗三次。
可選擇：含0.1-1%過氧化氫的PBS孵育5-10min，淬滅內(nèi)源過氧化物酶活性。PBS洗2次，5min/次。
注意：組織內(nèi)有豐富的生物素（引起高背景染色），建議甲醛固定，遵循石蠟包埋組織切片protocol，因為石蠟包埋組織中內(nèi)源性生物素被破壞。

C． 甲醛固定，石蠟包埋組織切片

按標(biāo)準(zhǔn)程序甲醛固定，石蠟包埋組織。
95%乙醇清潔玻片，涂一薄層黏附劑，自然晾干?；蚴褂妙A(yù)處理的玻片。
切片厚度4-6μm。二甲苯脫蠟，3次，5min/次。依次過梯度酒精水化：100%乙醇，2次，10min/次，95%乙醇，2次，10min/次。去離子水浸洗1min。甩去切片上多余的液體。

可選擇：可做抗原修復(fù)。甲醛固定和石蠟包埋導(dǎo)致某些抗原決定簇被封閉，可按以下方法修復(fù)暴露抗原位點：

i. 熱修復(fù)（推薦方法）：切片浸沒入10mM檸檬酸鈉緩沖液（sc-29109），pH6.0；或浸沒入含0.01% （w/v）EDTA（sc-29092）的50mM甘氨酸-HCl緩沖液（甘氨酸：sc-29096）中，pH3.5。95℃加熱5min。換新的緩沖 液，95℃加熱5min。（不同組織類型*孵育時間不同）。將切片放入緩沖液中冷卻約20min。用去離子水洗3次，2min/次。甩干切片。
ii. 胃蛋白酶：切片用含0.1%胃蛋白酶的0.01N HCl室溫孵育10-20min。去離子水沖洗幾次，甩去多余液體。
iii. 皂角苷：切片用含0.05%皂角苷的去離子水室溫孵育30min。PBS至少洗3次，甩去多余液體。

可選擇：切片在含0.1-1%過氧化氫的去離子水中孵育5-10min，淬滅內(nèi)源過氧化物酶活性，PBS洗2次，5min/次。

注意：組織內(nèi)有豐富的生物素（引起高背景染色），建議甲醛固定，遵循石蠟包埋組織切片protocol，因為石蠟包埋組織中內(nèi)源性生物素被破壞。

D．免疫過氧化物酶染色

切片的免疫酶染色，建議用Santa Cruz的ABC染色試劑盒或ImmunoCruzTM染色試劑盒。ABC染色試劑盒利用親和素-生物素化辣根過氧化物酶復(fù)合物作為檢測物；而 ImmunoCruzTM染色試劑盒利用鏈親和素辣根過氧化物酶復(fù)合物作為檢測物，該體系包括所有預(yù)稀釋好的第二抗體，即用型，也包括預(yù)稀釋的*抗體。 所有染色體系中均有完整的protocol；以下為簡化版protocol。
所有反應(yīng)步驟均于室溫下濕盒內(nèi)完成。使用前試劑盒試劑要先恢復(fù)至室溫。操作中切片不能過干。每步操作完用吸引管吸除試劑，避免切片過干。要用足夠的反應(yīng)液覆蓋標(biāo)本（通常100μl/張切片就足夠了）。

ABC染色試劑盒

PBS稀釋的1.5%封閉血清孵育1hr。理想的封閉血清和第二抗體為同種屬來源。從切片上去除封閉血清。
滴加*抗體室溫孵育30min或4℃過夜孵育。抗體*反應(yīng)濃度需經(jīng)滴定確定；建議用含1.5%封閉血清的PBS稀釋至0.5-5.0μg/ml。PBS洗3次，5min/次。
滴加預(yù)稀釋的生物素化第二抗體或用含1.5%封閉血清的PBS稀釋至1μg/ml的生物素化第二抗體，孵育30min。PBS洗3次，5min/次。
滴加親和素生物素酶反應(yīng)物，孵育30min。PBS洗3次，5min/次。
用提供的過氧化物酶底物孵育30s-10min或直至出現(xiàn)理想染色止。注意監(jiān)控單張切片的恰當(dāng)顯色時間。去離子水洗5min?？捎锰K木素（sc-24973）復(fù)染5-10s。迅速用去離子水洗幾次。
梯 度酒精，二甲苯依次脫水：浸沒入95%乙醇2次，10s/次，然后100%乙醇2次，10s/次，zui后二甲苯3次，10s/次。擦掉多余的二甲苯。迅速加 1-2滴封片固定劑（如Clarion，sc-24942），蓋上蓋玻片（sc-24975），光學(xué)顯微鏡下觀察。

ImmunoCruzTM染色試劑盒

滴加1-3滴血清封閉液孵育20min。甩去封閉液。
迅速加入1-3滴預(yù)稀釋的*抗體。如果所用染色系統(tǒng)不含預(yù)稀釋的抗體，就把*抗體用血清封閉液稀釋至0.5-5.0μg/ml。孵育2hrs。PBS沖洗，然后切片浸沒入PBS內(nèi)洗2次，2min/次。甩去多余的液體。
滴加1-3滴生物素化第二抗體，孵育30min。清洗同上步。
滴加1-3滴HRP-鏈親和素復(fù)合物，孵育30min。清洗同上步。
滴加1-3滴HRP底物混合物。顯色30s-10min，或直至出現(xiàn)理想染色止。去離子水沖洗，然后切片浸沒入去離子水內(nèi)洗2次，2min/次。
復(fù)染，脫水，封片。（同ABC染色試劑盒）

6．免疫熒光細(xì)胞染色

切片準(zhǔn)備同免疫酶染色，省去包括過氧化氫處理細(xì)胞在內(nèi)的zui后一步。
每步操作完吸除反應(yīng)液，但要避免樣品過干。用足夠的反應(yīng)液覆蓋樣品（100-500μl/張切片）。
滴加含10%封閉血清-PBS，孵育20min，減少和IgG結(jié)合的非特異位點。理想的封閉血清和第二抗體為同種屬來源。從切片上去除封閉血清。
滴加*抗體，孵育60min?？贵w*反應(yīng)濃度應(yīng)滴定決定；建議用含1.5%封閉血清的PBS稀釋至0.5-5.0μg/ml，PBS洗3次，5min/次。
滴加生物素標(biāo)記或熒光染料標(biāo)記的第二抗體（用含1.5%-3%封閉血清的PBS稀釋至1-5μg/ml），孵育45min。PBS洗3次。如果使用熒光染料標(biāo)記的第二抗體，須暗室孵育，并省略下步。
滴加鏈親和素-熒光素，暗室孵育15min。鏈親和素標(biāo)記物濃度需經(jīng)滴定決定；建議PBS稀釋至10-20μg/ml。PBS充分洗凈。
用水相固定劑或90%甘油PBS溶液封片。
選擇適當(dāng)?shù)臑V鏡在熒光顯微鏡下觀察。室溫避光保存切片（UltraCruzTM固片劑：sc-24941）或保存在4℃（甘油/PBS固片劑）。

7．流式細(xì)胞儀技術(shù)

細(xì)胞表面染色

準(zhǔn)備細(xì)胞
1） 溶解血紅細(xì)胞。（注意：準(zhǔn)備足夠的細(xì)胞用于10份樣品100μl/份檢測）。
1ml全血加入14ml恢復(fù)至室溫的1×FCM溶解液（sc-3621）中。
輕輕混勻，室溫孵育3-5min。不要超過5min。
離心5min，棄上清，預(yù)冷的5ml 1×PBS輕輕重懸沉淀。
離心5min，棄上清，預(yù)冷的1ml 1×PBS輕輕重懸沉淀。
2）準(zhǔn)備培養(yǎng)細(xì)胞。（注意：本protocol通常處理50ml培養(yǎng)細(xì)胞。單層細(xì)胞，切勿胰酶消化！用0.2%EDTA/PBS溶液代替。1×PBS洗細(xì)胞1次。）
血球計數(shù)儀計數(shù)細(xì)胞。
1000rpm離心5min，棄上清，用足夠的1×PBS輕輕重懸沉淀至終濃度為1×107細(xì)胞/ml。

各管加入熒光染料標(biāo)記的*抗體或isotype control。（20μl/106細(xì)胞。滴定抗體確定*濃度）。
每管加入100μl RBC溶解的全血或單細(xì)胞懸液。混勻，放在有蓋的冰盒內(nèi)孵育15-30min。
每管加入1.5ml FCM沖洗緩沖液（sc-3624），顛倒混勻。1000rpm離心5min，棄上清，500μl 1%多聚甲醛重懸沉淀。
測讀分析數(shù)據(jù)。

細(xì)胞內(nèi)染色

可用適當(dāng)?shù)幕钚晕镔|(zhì)刺激細(xì)胞。確保有未刺激細(xì)胞對照。
50ml離心管收集細(xì)胞。2000rpm離心5min，棄上清。
室溫1×PBS 20ml重懸細(xì)胞。
細(xì)胞計數(shù)。
2000rpm離心5min除去PBS。4℃1×PBS洗1次。2000rpm離心5min除去PBS。
每106個細(xì)胞加入1ml 4℃ FCM固定緩沖液（sc-3622），冰育15-30min。
4℃1×PBS洗細(xì)胞2次，離心，棄上清。
每106個細(xì)胞加入1ml -20℃ FCM滲透緩沖液（sc-3623），逐滴加入混懸。冰育15min。
離心；4℃ FCM沖洗緩沖液（sc-3624）。
2000rpm離心5min，棄上清。每107個細(xì)胞加入1ml FCM沖洗緩沖液，然后等分細(xì)胞（106）至各待測管中。
細(xì)胞內(nèi)著染：各管加入熒光染料標(biāo)記的*抗體或isotype control。室溫避光孵育1hr。

注意：為得到*結(jié)果應(yīng)滴定熒光染料標(biāo)記抗體。

1ml FCM沖洗緩沖液洗細(xì)胞2次， 500μl新鮮FCM沖洗緩沖液重懸。
24hrs內(nèi)檢測分析。

8．ELISA檢測

包被微孔板，靶蛋白用50mM碳酸鹽包被液（pH9.0）稀釋。*包被濃度須經(jīng)滴定，但純化抗原通常為1μg/ml，50μl/孔。封好，4℃過夜孵育。
棄凈液體。加入200μl/孔封閉液（含1%BSA和0.02%疊氮鈉的PBS）封閉非特異結(jié)合位點。室溫孵育1-2hrs或4℃過夜孵育。
棄凈液體。含0.02%疊氮鈉的PBS洗1次。濕潤的微孔條可用塑料密封袋密封，4℃保存4周。用前，棄凈多余的液體。
加入50μl/孔封閉液稀釋的待測樣品和對照?？贵w需梯度稀釋測定滴度或用以前的工作濃度作篩選或半定量。室溫孵育1hr。
含0.05%Tween-20（sc-29113）的PBS洗板3次，棄凈液體。
加入50μl/孔封閉液稀釋的1:100-1:1000的堿性磷酸酶標(biāo)記抗體。*抗體濃度需滴定決定。室溫孵育1hr。
棄凈液體。含0.05%Tween-20的PBS洗板3次，拍干，棄凈液體。
乙醇胺緩沖液（10mM乙醇胺，0.5mM MgCl2（sc-29098），pH9.5）洗1次，棄凈液體。
用乙醇胺緩沖液稀釋底物（PNPP，sc-3720）至終濃度1mg/ml。加入50μl/孔。反應(yīng)10-20min直到陽性對照OD405/490讀數(shù)達(dá)1.0。加入50μl/孔0.1M EDTA，pH7.5終止反應(yīng)。OD405/490讀數(shù)。

9、TRANSCRUZTM 超凝膠遷移檢測

用多聚核苷酸激酶將[γ32p]-ATP 標(biāo)記到寡核苷酸上，達(dá)到50,000cpm/ng
準(zhǔn)備膠遷移緩沖液：10mMTris,Ph7.5, 50mMNaCL,1mMDTT,1mM EDTA,5%甘油
準(zhǔn)備20ul的反應(yīng)混合物，將3-10ug核抽提物，和1ug多聚dIdC溶解在20ul膠轉(zhuǎn)移緩沖液中。加0.5ng標(biāo)記的寡核苷酸探針，室溫孵育20分鐘。這組成了檢測DNA-蛋白復(fù)合物的對照樣品
為了檢測抗體遷移或封閉DNA-蛋白復(fù)合物，按步驟3準(zhǔn)備反應(yīng)混合物，每20ul反應(yīng)體積加1-2ul TransCruzTM 超凝膠遷移抗體。一般是在加了探針之后，才加抗體，但在加探針前加入抗體，可使結(jié)果加強(qiáng)
通過4% 聚丙烯酰胺凝膠電泳（25-30ma）,分開DNA和蛋白復(fù)合物。凝膠中含50mMTris,Ph7.5, 2mM EDTA,0.38M甘油.待膠干后，自動放射顯影查看結(jié)果

10、肽的中和

對所有的santa cruz的親和純化的兔或山羊的多抗和單抗，都有相應(yīng)的封閉肽做對照。通過將抗體和封閉肽的預(yù)先孵育，抗體對抗原的結(jié)合可以被阻止。
決定zui高的抗體稀釋度，在這個稀釋度下，可以一直獲得理想的陽性結(jié)果。例如，H-Ras在免疫沉淀時，推薦的濃度是1ug/ml,但陽性結(jié)果是在50ng/ml。
封閉/競爭時，將抗體（抗體濃度按照以前提到的方法確定）和5倍重量的封閉肽混合在500ul的PBS中，室溫孵育2小時，或4度過夜。
封閉/競爭后，用封閉緩沖液稀釋抗體/封閉肽混合物，然后，按照所期望的實驗的操作進(jìn)行。

11，染色質(zhì)免疫沉淀

注意：CHIP的實驗步驟可以有很多不同版本，下面介紹的步驟適合大多數(shù)的實驗
常溫下，用PBS洗細(xì)胞，重懸細(xì)胞，使細(xì)胞數(shù)大約5*105個/ml（總細(xì)胞數(shù)2*107）。,
加甲醛，使終濃度為1%，室溫孵育10分鐘。
加甘氨酸至終濃度0.125M，終止交聯(lián)反應(yīng)
2000rpm,5分鐘，離心細(xì)胞。用冷的PBS洗細(xì)胞一次
用6ml的裂解緩沖液重懸細(xì)胞，輕柔混合，2000rpm離心5分鐘，收集粗提的核提取物。
再用PBS洗沉淀，沉淀可以凍存，或繼續(xù)以下步驟。
用1.9ml的高鹽裂解緩沖液重懸沉淀，轉(zhuǎn)移到2ml的離心管中準(zhǔn)備超聲
超聲條件需要優(yōu)化，下面介紹的條件是在使用Sonics VC130和3mm的探頭的基礎(chǔ)上建立起來的：
在冰上操作，輸出功率設(shè)置5（R）6,每隔30秒超聲一次，共4次。
4°C，10，000rpm 離心15分鐘，保存上清，確定上清中蛋白的濃度。
如果免疫沉淀，我們推薦100—500ug蛋白和0.1—1ul的TransCruz試劑（0.2—2ug）
注意：研究者可能希望使用連接有葡聚糖或磁珠的一抗，以便于選擇后續(xù)免疫沉淀的試劑。有些情況下，將針對同一種蛋白不同表位的抗體聯(lián)合使用會更好。
向染色質(zhì)溶液加50ul Protein A/G-瓊脂糖，4度，孵育30分鐘，使其澄清，zui大速度，4度離心5分鐘。
向上清中加一抗，4度孵育過夜。
加50ul Protein A/G –瓊脂糖，4度孵育2小時。
12，000rpm離心20秒收獲磁珠，并將管放在冰上
用1ml裂解緩沖液洗磁珠2次
用沖洗緩沖液洗磁珠四次
重懸磁珠在400ul洗脫緩沖液中
通過在67度水浴中孵育管子2小時以上，使反向交叉連接
離心去除磁珠，繼續(xù)在67度水浴孵育上清過夜 Remove
10,000rpm離心3分鐘去除殘留的珠子，保留上清
分離DNA,用500ul 酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）抽提上清,劇烈振蕩，14,000rpm離心3分鐘分離兩相。
保留水相，用100ul10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.1 （TE）  反向抽提有機(jī)相一次，在匯集水相
用600ul 氯仿/異戊醇抽提匯集的水相
DNA可以用商業(yè)化的試劑盒濃縮。

12. siRNA小干擾RNA

轉(zhuǎn)染
*天：準(zhǔn)備細(xì)胞
健康的細(xì)胞是成功轉(zhuǎn)染的要求，在轉(zhuǎn)染前明確細(xì)胞的生存狀態(tài)
對于貼壁細(xì)胞：
1，吸棄培養(yǎng)基，用胰蛋白酶、EDTA、或其他合適的方法分散細(xì)胞，在胰蛋白酶化前，用無菌的1X PBS漂洗細(xì)胞2次。
2，一旦細(xì)胞分散，用4倍體積的含10% 胎牛血清不含抗生素的生長培養(yǎng)基（如DEME,RMPI1640）稀釋懸浮液 。
（注意：這個階段使用不含抗生素的培養(yǎng)基是轉(zhuǎn)染成功的關(guān)鍵）
3，1,000 rpm離心5分鐘，去除培養(yǎng)基，用不含抗生素的培養(yǎng)基重懸沉淀
4，轉(zhuǎn)移細(xì)胞到12孔的細(xì)胞培養(yǎng)板 以便細(xì)胞過夜培養(yǎng)后，細(xì)胞覆蓋率達(dá)60-80%
（注意：細(xì)胞覆蓋率也是成功轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵）
對于懸浮細(xì)胞：
1，1,000 rpm離心5分鐘
2，去除培養(yǎng)基，用不含抗生素的含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基重懸沉淀
3，轉(zhuǎn)移細(xì)胞到12孔的細(xì)胞培養(yǎng)板或轉(zhuǎn)到多聚賴氨酸包被的8孔板中，以便細(xì)胞過夜培養(yǎng)后，細(xì)胞覆蓋率達(dá)60-80%
（注意：多聚賴氨酸包被是使懸浮細(xì)胞黏附到板底必須的）
第二天
 準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染
 注意：對于不同的實驗?zāi)康挠胁煌牟僮鞑襟E，請根據(jù)試驗需要選擇下面介紹的操作步驟。
對于蛋白和轉(zhuǎn)錄檢測
注意：當(dāng)在組織培養(yǎng)板中進(jìn)行不同劑量的siRNA轉(zhuǎn)染時，轉(zhuǎn)染試劑和siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基的用量需要與不同孔的表面積成比率。
1，對每一次轉(zhuǎn)染，在一個無菌的小管里準(zhǔn)備下面的混合物 這一步無關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)類型
 （A） 加3.6ul 10uM的siRNA到40ul siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中，輕柔混合，在室溫中放置15分鐘 （注意：如果需要低濃度的siRNA，用siRNA稀釋緩沖液進(jìn)行稀釋）
（B）加2.4ul siRNA轉(zhuǎn)染試劑到40ul的siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中，輕柔混合，室溫放置5分鐘。
注意：雖然siRNA轉(zhuǎn)染試劑對許多細(xì)胞都有很高的轉(zhuǎn)染效率，但并不是適用于所有的細(xì)胞
 2， 5分鐘后，混合A和B形成siRNA-siRNA轉(zhuǎn)染試劑混合物，輕柔混合，室溫孵育20分鐘。
 3， 然后，向每個含有siRNA-siRNA轉(zhuǎn)染試劑混合物的管中加入0.32ml的siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，輕柔混合
對貼壁細(xì)胞：
    4.1轉(zhuǎn)染前，吸棄培養(yǎng)基，用1ml無菌siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基洗細(xì)胞一次，棄培養(yǎng)基。
4.2在洗過的細(xì)胞上，鋪稀釋的siRNA-siRNA轉(zhuǎn)染試劑混合物，37度，5-7小時
4.3孵育后，向含有轉(zhuǎn)染細(xì)胞的每個孔中加0.4ml 生長培養(yǎng)基，其中的血清和抗生素濃度是正常濃度的兩倍，無需去除轉(zhuǎn)染混合物。如果，毒性是個問題的話，去除轉(zhuǎn)染混合物，以正常生長培養(yǎng)基代替。再孵育18-24小時
4.4孵育結(jié)束后，用新鮮正常生長培養(yǎng)基替換，繼續(xù)孵育24-72小時
4.5從細(xì)胞中吸棄培養(yǎng)基，用1ml 1*PBS洗細(xì)胞一次，然后丟棄
4.6放置在冰上，向孔中加入300ul 1*電泳緩沖液，用移液器吹打，混勻。（注意：混合物可能變得粘稠）
如果進(jìn)行Western blot的話，轉(zhuǎn)移混合物到15ml的錐形管中，放在冰上，對混合物進(jìn)行超聲波降解，每15秒一次，用輸出功率的40%。如果，超聲后，起很多泡泡，1000轉(zhuǎn)/秒，離心3分鐘，然后，按照western blot的方法進(jìn)行電泳，免疫印跡。
如果做轉(zhuǎn)錄分析，按照我們的半定量RT-PCR的操作進(jìn)行。
對懸浮細(xì)胞
4.1在轉(zhuǎn)染前，1000轉(zhuǎn)/秒， 離心5分鐘收集細(xì)胞。去除培養(yǎng)基，用1ml 無菌的siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基 。
4.2 再次離心1000轉(zhuǎn)/秒，5分鐘，去除培養(yǎng)基。用稀釋的siRNA-siRNA轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物重懸細(xì)胞。轉(zhuǎn)移細(xì)胞到12孔組織培養(yǎng)板，37°C孵育5-7小時，每次單獨轉(zhuǎn)染時重復(fù)。
4.3孵育后，加0.4ml含2倍正常血清和抗生物濃度的生長培養(yǎng)基到每個含被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的孔中，不要去除轉(zhuǎn)染混合物。如果有毒性的話，去除轉(zhuǎn)染混合物，代替以正常生長培養(yǎng)基，在額外孵育18-24小時。
4.4一旦孵育結(jié)束，離心細(xì)胞，去除培養(yǎng)基。用新鮮的正常生長培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。轉(zhuǎn)移細(xì)胞到12孔組織培養(yǎng)板，繼續(xù)孵育24-72小時。
如果  需要做western blot分析，則繼續(xù)以下步驟
轉(zhuǎn) 移混合物到15ml的錐形管中。將2*電泳上樣緩沖液用Milli-Q超純水稀釋到1* 。1000轉(zhuǎn)離心5分鐘，收集細(xì)胞，去除培養(yǎng)基，用1ml PBS洗細(xì)胞，重復(fù)一次，用300ul 1*電泳上樣緩沖液重懸細(xì)胞，放在冰上，對混合物進(jìn)行超聲波降解，每15秒一次，用輸出功率的40%。如果，超聲后，起很多泡泡，1000轉(zhuǎn)/秒，離心3 分鐘，然后，按照western blot的方法進(jìn)行電泳，免疫印跡。
如果需要轉(zhuǎn)錄分析，參照半定量RT-PCR步驟。

免疫熒光檢測
注意：當(dāng)在組織培養(yǎng)板中進(jìn)行不同劑量的siRNA轉(zhuǎn)染時，轉(zhuǎn)染試劑和siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基的用量需要與不同孔的表面積成比率。
1，準(zhǔn)備以下混合物：
（A）加1.8ul的10um siRNA到20ul 的siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中，輕柔混合，在室溫放置5分鐘  注意：如果需要低濃度的siRNA，用siRNA稀釋緩沖液稀釋
（B） 加1.2ul siRNA轉(zhuǎn)染試劑到20ul siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中，輕柔混合，室溫放置5分鐘。注意：雖然，對多種的細(xì)胞系有很高的轉(zhuǎn)染效率，但siRAN轉(zhuǎn)染試劑并不是對所有細(xì)胞都適合。
2，5分鐘后，混合A和B，形成siRNA-siRNA轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物，輕柔混合，室溫孵育20分鐘。
3，孵育后，加160ul siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基到每個含有siRNA-siRNA轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物的管中，輕柔混合
  從這一步起，對懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的處理方法相同
4，轉(zhuǎn)染前，吸棄培養(yǎng)基，用0.3ml無菌siRNA轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基洗細(xì)胞一次，去除培養(yǎng)基。
5，在洗過的細(xì)胞上，鋪稀釋的siRNA-siRNA轉(zhuǎn)染試劑混合物，37度，5-7小時
6，孵育后，向含有轉(zhuǎn)染細(xì)胞的每個孔中加200ul 生長培養(yǎng)基，其中的血清和抗生素濃度是正常濃度的兩倍，無需去除轉(zhuǎn)染混合物。如果，毒性是個問題的話，去除轉(zhuǎn)染混合物，以正常生長培養(yǎng)基代替。再孵育18-24小時
7,孵育結(jié)束后，用新鮮正常生長培養(yǎng)基替換，繼續(xù)孵育24-72小時
8,使用恰當(dāng)?shù)牟僮鞑襟E檢測細(xì)胞，參見免疫熒光染色步驟

13，半定量RT-PCR

cDNA合成
準(zhǔn)備試劑：1ul oligo（dT） 12-18（500 µg/ml）
1 ng-5 µg 總 RNA
1 µl 10 mM dNTPs
用不含RNA酶的去離子水補(bǔ)加到總體積12 µl
70℃ 孵育 5 分鐘，迅速放在冰上，再加入
4 µl 5x反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液
2 µl 0.1 M DTT
1 µl RNase 抑制劑
42℃孵育 2 分鐘。
加1 µl 反轉(zhuǎn)錄酶（200 units）
  42℃ 孵育 50 分鐘，然后，
在70℃孵育15 分鐘 終止反應(yīng)
注意：作為優(yōu)化的步驟，加1 µl RNase H （2 unit/µl）
37℃ 孵育20分鐘

*輪PCR 反應(yīng)：
準(zhǔn)備以下試劑
5 µl 10x PCR 緩沖液（含或不含MgCl2）
*5 µl 25 mM MgCl2 （調(diào)整不同的MgCl2濃度,推薦終濃度 2.5 mM）
1 µl 10 mM dNTP
1 µl 引物對 A
1 µl Taq DNA 聚合酶
2 µl cDNA 加水使體積達(dá)到50 µl
 94℃孵育 2 分鐘，變性 cDNA.
進(jìn)行的15–40 個循環(huán)的 PCR.退火和延伸反應(yīng)是根據(jù)引物和模板情況依經(jīng)驗而確定的。

第二輪 PCR 反應(yīng)
準(zhǔn)備以下試劑
5 µl 10x PCR 緩沖液（含或不含MgCl2）
*5 µl 25 mM MgCl2 （調(diào)整不同的MgCl2濃度,推薦終濃度 2.5 mM）
1 µl 10 mM dNTP
1 µl 引物對 B
1 µl Taq DNA 聚合酶
1–5 µl *次PCR 產(chǎn)物，并補(bǔ)加水到50 µl
94℃孵育 2 分鐘變性 cDNA.
進(jìn)行的15–40 個循環(huán)的 PCR.退火和延伸反應(yīng)是根據(jù)引物和模板情況依經(jīng)驗而確定的。
PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中，EB染色后可見。