一．納米抗體免疫文庫(kù)

構(gòu)建免疫文庫(kù)較為特殊而重要的步驟是動(dòng)物免疫，使駱駝重鏈V區(qū)胚系基因片段V、D和J在CDR3結(jié)構(gòu)域隨機(jī)位點(diǎn)處發(fā)生組合性重排。促使駱駝身體產(chǎn)生特異性重鏈抗體的方法類似于從其它動(dòng)物中獲取傳統(tǒng)抗體，主要是周期性的連續(xù)給動(dòng)物注射偶聯(lián)有佐劑的抗原一段時(shí)間，使機(jī)體對(duì)抗原產(chǎn)生充分的免疫反應(yīng)以生成特異性強(qiáng)、親和力高的重鏈抗體。免疫結(jié)束后，從駱駝血液中分離淋巴細(xì)胞，提取總RNA，再以RNA為模版，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA文庫(kù)；根據(jù)重鏈抗體保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，采用巢式PCR技術(shù)經(jīng)過(guò)2-3輪PCR擴(kuò)增VHH基因片段，同時(shí)引入合適的酶切位點(diǎn)（如PstI和NotI）。接著，將VHH基因克隆到噬菌粒載體（如pHEN4和pMECS）上，與噬菌體基因II蛋白（gIIp）融合表達(dá)，從而展示在噬菌體表面以供特定的抗原識(shí)別篩選。再將重組的噬菌粒載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細(xì)胞并進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增，從而形成抗原傾向性的免疫文庫(kù)刀。文庫(kù)的質(zhì)量一般可以從文庫(kù)庫(kù)容和多樣性等方面進(jìn)行評(píng)估。

二．納米抗體噬菌體展示文庫(kù)的構(gòu)建

1.TG1電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備

（1）將TG1細(xì)胞劃線培養(yǎng)在LB板上，37 °C倒置培養(yǎng)過(guò)夜；

（2）挑取單個(gè)克隆接種在5 mL 2xTY培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)過(guò)夜；

（3）接種2 mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液至300 mL 2xTY培養(yǎng)基中，37 °C, 220 rpm培養(yǎng)至0D600為1左右；

（4）將菌液放在冰中1 h，1 h后將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中， 4 °C， 4000 rpm離心15 min;5)棄上清，加入等體積的1 mM，pH 7.0的Hepes溶液(冰上預(yù)冷)重懸菌體， 4 °C，4000 rpm離心15 min；

（6）加入1/2體積的10%甘油重懸菌體，4 °C，4000 rpm離心15 min；

（7）棄上清,每個(gè)管中加入10 mL 10%甘油重懸菌體， 4 °C， 4000 rpm離心15 min，棄上清，用槍吸去殘留液，加入10%甘油至終體積1 mL。

2.TG1感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率檢測(cè)

（1）取2 μL pMECS質(zhì)粒（10 ng/μL）加入到48 μL制備好的TG1感受態(tài)細(xì)胞，輕彈混勻，置冰上1 min。

（2）轉(zhuǎn)入電擊杯中（-20 °C預(yù)冷），電壓設(shè)置為1700 V，進(jìn)行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)完立即用800 μL 37°C預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基混勻吸出，轉(zhuǎn)至試管中；

3) 37 °C, 220 rpm搖床培養(yǎng)1 h,取出菌液,梯度稀釋,最終取100 μL涂在LA+GLU板上，37 C培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)算轉(zhuǎn)化效率;

3.噬菌體納米抗體文庫(kù)的形成

（1）感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率檢測(cè)完成后，將100 μL的連接產(chǎn)物加至1 mL的電轉(zhuǎn)TG1感受態(tài)中，混勻；

（2）在每個(gè)電擊杯中(-20 °C預(yù)冷)分裝40 μL感受態(tài)，將電擊杯置入電轉(zhuǎn)儀，1700V電擊，使重組噬菌粒進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞；

（3）電擊結(jié)束后加入SOC培養(yǎng)基1 mL，吹打電擊杯，轉(zhuǎn)入37 °C預(yù)熱的錐形瓶中，最后再用2 mL SOC培養(yǎng)基將所有電擊杯洗刷一-次，轉(zhuǎn)入錐形瓶，37 °C搖床培養(yǎng)1 h；

（4）1h后，將菌液收集到50mL離心管，25°C，4000rpm離心10min，用5mLSOC重懸菌體，取出50 μL用以梯度稀釋，以便測(cè)定庫(kù)容。其余菌液平均涂在10個(gè)LA+GLU板.上，37°C，培養(yǎng)16 h；

（5）將培養(yǎng)好的板取出，每個(gè)板加入5 mL液體LB培養(yǎng)基，用涂布棒將菌體刮下，倒入錐形瓶，再用3 mL LB沖洗-遍板，并入錐形瓶；

（6）將菌液轉(zhuǎn)入50 mL離心管，25 °C，4000 rpm離心10 min,棄上清。加入30 mL15%甘油+LB液體培養(yǎng)基，漩渦振蕩重懸，分裝于1.5 mL EP管，-80 °C保存?zhèn)溆谩?/span>

圖1 文庫(kù)構(gòu)建流程

三．噬菌體構(gòu)建技巧

噬菌體文庫(kù)的庫(kù)容量和多樣性是衡量文庫(kù)質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，容量越大、多樣性越好的庫(kù)是成功篩選出納米抗體的有效保證；

影響文庫(kù)容量和多樣性的關(guān)鍵點(diǎn)包括：提取RNA過(guò)程中RNA的降解、反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的模板和引物、擴(kuò)增過(guò)程中引物的選擇和模板的用量以及PCR擴(kuò)增輪數(shù)、感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率、連接體系的大小等因素。

泰克生物可為客戶提供來(lái)自駝源VHH納米抗體庫(kù)，以及其他物種scFv形式抗體的酵母展示文庫(kù)構(gòu)建及篩選服務(wù)。VHH納米抗體庫(kù)，又稱為駝源重鏈抗體文庫(kù)，抗體分子量大小為15kDa，是駝源動(dòng)物產(chǎn)生的一種抗體。酵母抗體文庫(kù)展示體系受限于自身物理特性限制，物理庫(kù)容滴度一般<10⁷，因此主要應(yīng)用于客戶對(duì)項(xiàng)目庫(kù)容要求不高，動(dòng)物免疫后PBMC細(xì)胞經(jīng)過(guò)二次分選以及避免漏掉二硫鍵形成的抗體發(fā)現(xiàn)項(xiàng)目。同時(shí)酵母展示文庫(kù)相對(duì)噬菌體展示文庫(kù)技術(shù)而言，前者在微量抗體表達(dá)后抗體活性層面相較于后者要高，得益此基礎(chǔ)，在流式篩選時(shí)就能區(qū)分抗體的親和力高低。