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          多功能酶標儀靈敏度影響因素探究

          來源:迪圖(上海)生物科技有限公司   2023年08月09日 19:44  

          現(xiàn)在,多功能酶標儀基本上是每個生物學實驗室的基礎科研設備。市場上多功能酶標儀品牌主要有Bio-Tek、BMG、MD、PE、Tecan等。每個品牌都有自己的特色和優(yōu)勢產品。而各品牌廠家在對自己產品性能-比如說檢測靈敏度的描述時,除了表征光吸收值的OD值參數(shù)外,像熒光檢測靈敏度、發(fā)光檢測靈敏度等,卻往往沒有一個統(tǒng)一的方式和定義(名稱等)。這對用戶在選購酶標儀時進行儀器間性能的對比會帶來一定的困惑。我們來看看市場上的優(yōu)勢品牌在對熒光檢測靈敏度這一參數(shù)的不同的描述:





             ,對于靈敏度的描述,主要有“Sensitivity”和“Detection Limit”兩種說法,我們分別來看它們的定義:
                 A: Detection Limit: 檢出限,這里有兩種理解:分析方法檢出限儀器檢出限


                 1.分析方法的檢出限:國際理論與應用化學聯(lián)合會(IUPAC)對檢出限的規(guī)定:對各種光學分析方法,可測量的最小分析信號XL以下式表示:

          • XL=Xb+kSb

          • 式中Xb―空白多次測定的平均值(n≥20)

          • Sb-空白多次測定的標準偏差

          • k-根據(jù)一定置信水平確定的系數(shù)(IUPAC規(guī)定k=3,此時的置信水平為90%)。為了提高檢出限的可靠性,人們還提出了保證檢出限(Limit of Guaranteed Detection)的概念,也就是上述DL公式中k=6時的檢出限。


                 2.儀器檢出限:用于評價儀器的檢測能量,即:相對應背景,儀器可靠檢測的最小信號,通常用信噪比S/N來表示,為S/N≥K,根據(jù)置信度概念,K可取2或3,為合理的賦予值。

                 B: Sensitivity:靈敏度。對于靈敏度概念而言,在IUPAC的定義是:方法的靈敏度m表示被測組分濃度或含量改變一個單位時所引起的分析信號的變化,即m=dX/dc。其中X為分析信號,c為濃度或含量。在分析方法的校正曲線上,一般可以認為靈敏度就是分析校正曲線的斜率。曲線斜率越大,表示靈敏度越高。但在儀器參數(shù)中所說的“Sensitivity”并不是表示這一概念,而是具體指的是“DL(Detection Limit)或LOD(Limit Of Detection)”,比如BMG在Sensitivity的注解中就明確說明指的是“LOD”。如果上述(表中)參數(shù)描述的“Detection Limit”(Tecan/MD/PE)指的是“方法檢出限”且“Sensitivity”(BMG/Bio-Tek/Thermo)指的是“LOD”時,則Sensitivity=LOD=DL=Detection Limit。雖然描述詞不同,但是概念是相同的,其參數(shù)可以直接比較。


                 目前從各廠家公開的資料中,只有BMG明確說明采用國際理論與應用化學聯(lián)合會(IUPAC)的檢測標準去例明參數(shù)。也只有BMG公司在參數(shù)中明確寫明了其Sensitivity的定義,包括定義、詳細的測定條件等。例如在BMG最新推遲的高性能漸變?yōu)V片型光柵多功能酶標儀CLARIOstar的參數(shù)描述中,其FI(熒光)頂讀的靈敏度為FI Filters (top) < 0.4 pM (< 8 amol/well Fluorescein, 384sv, 20 μL),就在參數(shù)后面明確寫明了測試靈敏度時的方法:采用熒光素(Fluorescein)為底物做6點的標準曲線,采用的是384 Small Volume微孔板,20μL的檢測體系。這里要清楚知道,測定參數(shù)時采用的微孔板類型以及檢測體系的體積非常重要。因為不同的條件,其靈敏度計算結果是不一樣的。下面表2為各酶標儀廠家的網站的參數(shù)資料:





                每個廠家都有不同的標準去定出其檢測靈敏度。一般會把所用的檢測濃度和質量寫出來,但也有些廠家或型號只例出濃度單位,例如:Bio-Tek Neo,MD SpectraMax M5/M3等。要全面比較檢測靈敏度,其實要配合濃度、質量和檢測體積幾個要數(shù)作考慮。如果只有濃度(M),那實際檢測的體積是多少?200μl?100μl或是20μl?不同的體積會使實際檢測的質量不同,這可以是十倍或更多的差別。

                 除此之外,統(tǒng)一性的檢測標準也很重要。例如:BMG所有型號的頂讀熒光每次都會用384 small volume微孔板,并以20μl的體積進行檢測。從表2中可以看到由中端研究型的FLUOstar Omega到  的PHERAstar FS都是用統(tǒng)一的檢測標準去量度和顯示其靈敏度。如果型號間的檢測標準不一,如Tecan入門型號F200和高型號F500的參數(shù),前者是用100μl做出的;后者是用10μl做出的。這樣用戶會發(fā)現(xiàn)一個有趣現(xiàn)象 – 就是單看濃度,F(xiàn)200(0.85pM)入門型好像比F500(1pM)高 型號更靈敏!當然用戶也會有疑問,為什么較低端F200比 的F500要多用10倍體積?大家同樣是384孔板,為什么檢測的體積標準不一樣呢?那是否那100μl做出來的參數(shù)用20μl時可以做出同樣的靈敏度(85 amol)?這相信值得用家去思考一下。

                 BMG的所有參數(shù)是根據(jù)IUPAC標準去檢測出來,所用的方法、體積、微孔板、濃度和質量等,都清楚例明。在384孔板中一貫采用20μl體積是因為這是接近實際實驗的情況。有些廠家所用的檢測體積與現(xiàn)實情況其實有差距,例如Biotek的Synergy 2熒光參數(shù)標示為:“Fluorescein 1 pM typical (0.1 fmol/well 384-well plate) – Top”,雖然廠家沒有寫出來,但只要小心計算,可得出384孔板時的參數(shù)是用100μl的體積去做檢測。實際上,市場上的384孔板的每孔體積一般只有約110μl (例如:CORNING),而微孔板廠家推薦使用體積為20μl -80μl。如果用100μl去做檢測是有點不太現(xiàn)實,因為體積太滿會令孔內液體在檢測移動過程中比較容易淺出,這也使孔板在實驗過程中無法使用振動功能去搖勻孔內的樣本,影響檢測結果。再者,使用384孔板的原因除了因為高通量外,更重要的是想用更小的樣本和試劑體積。如果在384孔板上要用到100μl的試劑樣本,那跟原來想節(jié)省成本的原意就背道而馳了。當然,檢測體積愈小,對儀器的檢測靈敏度要求愈高,對廠家挑戰(zhàn)也愈大。但BMG寧可放棄用較大體積做出來的漂亮參數(shù),也要忠于實際操作,用小體積做出參數(shù)給客戶參考。事實上,即使是BMG最入門的Optima系列的化學發(fā)光和熒光酶標儀,也被客戶用來發(fā)表了超過110份Nature或Nature Publishing Group的文章,其優(yōu)良的性能實際是不容懷疑。

                 綜合以上各方面,在對酶標儀的參數(shù)進行對比時,單位的統(tǒng)一非常重要,同時測定參數(shù)時采用的條件同樣重要。對于眾多廠家的儀器,其實很難用一個 一樣的方法去比較,因為不同廠家所用的條件都不一樣。畢竟儀器的性能和表現(xiàn)是要用家使用出來,而不只是靠把參數(shù)寫得漂亮。

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