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合成生物學是生物學工程化高度交叉的前沿學科研究領域，包含幾個不同的研究層次：認識生命、改造生命和創(chuàng)造生命；要想實現(xiàn)其終極目標，還需要在生命本質探索及相關技術的不斷創(chuàng)新與應用上持續(xù)深入?；蚓庉嫾夹g是合成生物學領域的一類重要工具，能夠實現(xiàn)基因組的定向修改，如插入、刪除、修改、替換。
本期內容聚焦一項發(fā)表在 Nature Biotechnology 上的基因編輯創(chuàng)新研究，來自于美國麻省理工科赫綜合癌癥研究所的腫瘤生物學家 Francisco J. Sánchez-Rivera，題目為“Base editing sensor libraries for high-throughput engineering and functional analysis of cancer-associated single nucleotide variants”[1]。該研究通過構建一個可以測量堿基編輯器工作效率及精度的“傳感器”文庫工具，并提供相應的線上應用軟件 BE-SCAN，助力其他研究者更加容易地設計基于堿基編輯器的分子元件，加速實現(xiàn)研究目的。本文中的“傳感器”文庫是由安捷倫 SurePrint 高保真寡核苷酸文庫合成平臺提供的。
該研究的亮點包括：
1
獨創(chuàng)性設計了堿基編輯“傳感器”，為單堿基變異的高通量篩選和功能研究提供有力工具；
2
通過檢測 20 萬種“堿基編輯器 -sgRNA- 細胞類型”組合，為“傳感器”工具積累了充分數(shù)據(jù)；
3
利用體外細胞和體內動物實驗，驗證“傳感器”在構建單堿基突變體和高通量功能篩選上的有效性，并且發(fā)現(xiàn)之前未被研究報道過的重要 TP53 突變位點；
4
搭建了靈活的生信方法 AMINEsearch 和線上軟件 BE-SCAN，可以幫助更多研究者進行單堿基突變研究。
堿基編輯器和
堿基編輯“傳感器“工具
CRISPR/Cas9 介導的經(jīng)典基因編輯技術[2]，通過 Cas9 蛋白在 DNA 靶標形成雙鏈斷裂（DSB），利用體內的修復機制，產生定向插入、刪除等隨機修飾，但很難實現(xiàn)精準的單堿基替換。然而，單堿基變異可以導致很多已知疾病的發(fā)生，與日俱增的基因組測序研究也在積累大量意義不確定的點突變，因此堿基編輯器（BE）技術應運而生 [3]。與經(jīng)典的 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)相比，BE 技術主要對Cas9蛋白模塊做了修改，一方面將 Cas9 蛋白切割產生雙鏈斷裂功能失活，另一方面在失活的 Cas 蛋白上融合脫氨酶模塊，從而實現(xiàn)單堿基的替換，如將某位點的 C 轉換成 T 的胞嘧啶堿基編輯器（CBE）。
本文就是在 CBE 的基礎上，構建了堿基編輯器“傳感器”工具，用來檢測多種 CBE 系統(tǒng)的編輯效率和精準度。如圖 1 所示，在慢病毒載體上，將 sgRNA 序列與對應的同源目標序列順式連接，形成“傳感器”序列。將裝載不同“傳感器”序列的載體轉染到可以表達堿基編輯酶組分的細胞系后，可以實現(xiàn)高通量堿基編輯。通過進一步對“傳感器”編碼區(qū)域進行 PCR 擴增和高通量測序，就可以測量每個具體的“編輯器 +sgRNA+ 靶標序列”的堿基編輯效率。
圖 1. 堿基編輯“傳感器”示意圖
構建基于真實世界臨床腫瘤數(shù)據(jù)的
堿基編輯“傳感器”文庫
如圖 2 所示，為了使堿基編輯“傳感器”的元件設計更加簡便，作者團隊搭建了一款設計算法 AMINEsearch。接下來，作者從腫瘤大 panel 檢測項目 MSK-IMPACT 的分析數(shù)據(jù)中提取了部分突變數(shù)據(jù)集，通過 AMINEsearch 軟件，設計出人的腫瘤傳感器文庫（HBES），共包括 5855 個 sgRNAs 序列、靶向 1450 個點突變。通過將 HBES 比對到小鼠的同源序列位點，設計出針對小鼠的腫瘤傳感器文庫（MBES），共包括 4686 個 sgRNAs 序列、靶向 1177 個點突變。
圖 2. 堿基編輯“傳感器”算法和線上應用示意圖
值得一提的是，在初步構建兩個文庫時，作者發(fā)現(xiàn)有將近一半的文庫序列發(fā)生了錯誤。在反復試錯和優(yōu)化后，最終通過與安捷倫合作，使用 SurePrint 高保真 OLS 平臺，才得以合成低錯誤率的“傳感器”序列。如作者所言，“這真的是我們可以合成傳感器結構的唯一方式”。
圖 3. 文章的方法部分，使用安捷倫 SurePrint 高保真寡核苷酸文庫合成平臺構建“傳感器”序列
在后續(xù)的文庫篩選中，HBES 和 MBES 被分別轉染到可以表達堿基編輯系統(tǒng)的細胞系 MDA-MB-231 中，共測試了三種堿基編輯系統(tǒng)。結果分析發(fā)現(xiàn)，PAM 模式、目標胞嘧啶位置和雙核苷酸序列背景對堿基編輯效率有顯著影響。為了進一步探索不同細胞系的表現(xiàn)，作者又納入 4 種額外的細胞系，并發(fā)現(xiàn)雖然不同細胞系的編輯效率不一，但在 PAM 偏好性、編輯窗口容許范圍和單一 sgRNA 序列編輯效率上是高度一致的。至此，本研究共檢測 20 萬種“堿基編輯器 -sgRNA- 細胞類型”的組合，為“傳感器”工具積累了充分數(shù)據(jù)。除了關注目標位點 C-T 轉化結果，作者還對非靶標 C-T 轉化和非經(jīng)典的 C-G 顛換進行分析，因篇幅限制不再贅述。
驗證三連擊
內源目標編輯驗證+
小規(guī)模功能驗證+高通量功能挖掘
內源目標編輯驗證：
在利用“傳感器”工具在細胞內引入堿基編輯時，此效應會同時作用在傳感器同源序列和細胞的內源序列。為了檢測兩種效應間的一致性，作者進行了 13 個 sgRNA 的小規(guī)模測試。結果表明（圖 4），在 50% 的情況下，內源編輯效率與“傳感器”數(shù)據(jù)的差距在 10% 以內，顯示了“傳感器”對內源目標編輯效率預測的有效性。
圖 4. 內源目標基因編輯效率驗證（vs“編輯器”預測數(shù)據(jù)）
小規(guī)模功能驗證：
TP53 是常見的腫瘤抑制基因，在腫瘤組織中發(fā)生突變的頻率高，且有較高的突變異質性 [4]，故作為小規(guī)模功能驗證的靶標基因。在小鼠文庫（MBES）的候選者中，挑選了 5 條編輯效率較高、不容易引起額外突變的 sgRNA 序列進行后續(xù)驗證實驗。在小鼠胰腺癌模型細胞系生長實驗中，相比于對照細胞，引入堿基編輯的細胞系在 Nutlin-3（一種促進 TP53 抑癌效應的物質）添加的環(huán)境中生長情況更好，顯示了 TP53 功能在一定程度上得到了抑制。如圖 5，進一步在小鼠中的體內實驗結果顯示，移植了被堿基編輯的細胞系的小鼠，在 100 天內均因胰腺腫瘤死亡。對腫瘤組織進行分析，發(fā)現(xiàn)目標位點發(fā)生了大量的 C-T 突變。
圖 5. 小規(guī)模功能驗證結果
高通量功能挖掘：
因為“傳感器”工具可以同時編輯傳感器序列和內源序列，因此內源序列突變導致的細胞表型變化可以與傳感器序列編輯效率相關聯(lián)，并且理論上也可以發(fā)掘已經(jīng)發(fā)生單堿基突變但未導致顯著表型效應的位點。如圖 6 所示，將小鼠文庫（MBES）進行小鼠胰腺癌模型細胞系轉染，通過體外細胞增殖篩選，發(fā)掘到 150 個對增殖生長有顯著效應（促進或者抑制）的 sgRNA。其中有促進生長作用的 sgRNA 靶向不少與致癌（如 Jak3、Fgfr2）或抑癌（如 Trp53、Apc）有關的基因。在這些候選 sgRNA 中，進一步對靶向 Trp53 位點進行功能挖掘，找到一系列在體內和/或體外編輯效率較高的位點，其中點突變位點 T211I（小鼠中對應位點是 T208I）被認定為胰腺癌小鼠模型中的驅動突變。
圖 6. 高能量功能挖掘流程示意圖
結語
堿基“傳感器”的線上軟件工具 BE-SCAN 已經(jīng)開發(fā)，網(wǎng)站地址是 https://dowlab.shinyapps.io/BEscan/，可以為其他研究者提供驗證數(shù)據(jù)參考和元件設計支持。
未來，Sánchez-Rivera 博士團隊將把“傳感器”工具拓展到“先導編輯”技術中，進一步擴大該工具的基因編輯應用范圍。
安捷倫 SurePrint 寡核苷酸合成平臺將繼續(xù)為廣大研究者提供最高質量的底層工具，助力科學創(chuàng)新更進一步！
圖 7. SurePrint DNA 寡核苷酸合成技術示意圖
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參考文獻：
[1] Sánchez-Rivera, F.J., Diaz, B.J., Kastenhuber, E.R. et al. Base editing sensor libraries for high-throughput engineering and functional analysis of cancer-associated single nucleotide variants. Nat Biotechnol 40, 862–873 (2022).
[2] Martin Jinek et al. A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity.Science337,816-821(2012).
[3] Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420–424 (2016).
[4] Kastenhuber, E. R. & Lowe, S. W. Putting p53 in context. Cell 170, 1062–1078 (2017).
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