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細(xì)胞學(xué)堂 | 貼壁細(xì)胞6大培養(yǎng)難題原因和解決方法
貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)時要貼附于培養(yǎng)（瓶）器皿壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進(jìn)入對數(shù)生長期。
傳代后細(xì)胞全部飄起
解決方法：檢查所使用的培養(yǎng)基的顏色是否偏紫色（如圖1），檢查瓶蓋是否透氣，不透氣瓶蓋是否被擰松。
圖1. 培養(yǎng)基顏色偏紫
通常培養(yǎng)基偏堿，顏色就會偏紫，主要是因為培養(yǎng)基里的酚紅指示劑遇酸變黃、遇堿變紫，培養(yǎng)基量太少，或培養(yǎng)基存放時間太長時都會變堿。建議配好完-全培養(yǎng)基后分裝到50mL離心管并于一周內(nèi)用完，量少時放到15mL離心管里保存。
傳代后部分細(xì)胞漂浮
原因及解決方法如下
傳代前細(xì)胞密度太大：一般細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時可進(jìn)行傳代操作，傳代密度需適中，傳代密度過高也會導(dǎo)致傳代后漂??；
細(xì)胞狀態(tài)不好：可通過提高血清比例、穩(wěn)定培養(yǎng)環(huán)境等方法進(jìn)行改善；
吹打次數(shù)過多造成機(jī)械損傷：輕柔吹打，細(xì)胞呈單顆粒時可停止吹打，吹打過程避免氣泡產(chǎn)生；
培養(yǎng)基更換后不適應(yīng)：更換回原來的培養(yǎng)基；或者與原培養(yǎng)基比例混合后使用，使細(xì)胞有個適應(yīng)期。
傳代后細(xì)胞變形
原因及解決方法如下
1）變形，但細(xì)胞還在生長：可能是血清批次不一樣導(dǎo)致，血清成分復(fù)雜，不同批次和品牌間均存在成分差異，影響細(xì)胞狀態(tài)。建議使用同一批次血清，更換血清時需與原血清比例混合后使用，使細(xì)胞有過渡期；
2）變形，但細(xì)胞不長，且碎片增多：可能傳代操作過程損傷，常見于消化不當(dāng)，或者潛在支原體等污染導(dǎo)致細(xì)胞病態(tài)；消化時間根據(jù)每個細(xì)胞的狀態(tài)來調(diào)整，消化過度或者消化不充分均會對細(xì)胞造成影響；培養(yǎng)過程應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，實驗環(huán)境盡量潔凈，確保細(xì)胞無外源污染。
細(xì)胞生長周期變慢，邊養(yǎng)邊漂
原因及解決方法如下
細(xì)胞傳代時密度太稀或太密：建議細(xì)胞密度達(dá)80%左右進(jìn)行傳代，傳代密度適中，密度過低會延長生長周期；
傳代操作不當(dāng)：根據(jù)細(xì)胞特性決定細(xì)胞消化時間，一般在顯微鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓并有少量細(xì)胞脫落即可終止消化，難消化的細(xì)胞可分次消化，每次時間不超過5min；頻繁換液或者清洗細(xì)胞也會導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差，常規(guī)換液時間間隔為2~3天。
傳代后細(xì)胞成團(tuán)
解決方法如下
低密度接種，延長換液時間，防止細(xì)胞脫落；
使用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)器皿，以增加細(xì)胞貼壁牢固度，降低細(xì)胞聚集成團(tuán)的幾率；
重新鋪板，并更換新配制的培養(yǎng)基，加大血清比例（增加比例不超過5%）；
接種時，減少培養(yǎng)基量（如T25加3mL）以加快細(xì)胞貼壁速度，等待細(xì)胞貼壁后（約8-12小時），再補(bǔ)加培養(yǎng)基到正常用量。
細(xì)胞出現(xiàn)空泡
原因及解決方法如下
1）正常的細(xì)胞活動：有的細(xì)胞有正常的自噬行為或其他膜泡活動，無需特殊處理（如Caco-2細(xì)胞）；
2）血清不適應(yīng)、培養(yǎng)基成分改變、換液不及時等造成細(xì)胞營養(yǎng)不良：可通過更換更合適的血清或及時換液等方法解決；
3）機(jī)械損傷、PH偏高或偏低等造成細(xì)胞受損：注意培養(yǎng)條件及操作手法。
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