青光眼是一種視神經(jīng)丨 病變，約6000萬人受到影響，是目前導致不可逆失明的最常見疾病之一。高眼壓導致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)丟失、軸突變性與青光眼發(fā)病的機制有關(guān)，青光眼視神經(jīng)丨病變除了高眼壓外還與其他多種因素相關(guān)。目前，青光眼的藥物治療僅限于降眼壓劑;因此，為了保護RGCs免受有害因素影響，急需新藥研發(fā)。為了加快青光眼藥物的研發(fā)，有必要研究青光眼的病理生理和分子機制。G蛋白偶聯(lián)受體3 (GPR3)可促進神經(jīng)軸突生長和神經(jīng)元存活，然而，GPR3在視神經(jīng)元損傷后軸突再生中的潛在作用尚未闡明。

為了弄清該病的病理及其分子機制，日本廣島大學的研究人員研究了小鼠視網(wǎng)膜損傷后GPR3在小鼠RGCs中的表達及參與的軸突再生機制。研究團隊在國際科學期刊Neurobiology of Disease上發(fā)表了題為“GPR3 expression in retinal ganglion cells contributes to neuron survival and accelerates axonal regeneration after optic nerve crush in mice ”的文章，研究表明，GPR3在RGCs中的表達有助于維持小鼠視神經(jīng)擠壓（ONC）后神經(jīng)元的存活并且聯(lián)合酵母聚糖處理可進一步增強再生軸突的作用。

神經(jīng)元損失是由損傷后細胞內(nèi)cAMP下調(diào)引起的，cAMP下調(diào)降低了特定神經(jīng)營養(yǎng)因子的反應(yīng)性，從而導致RGCs死亡。GPR3在各類神經(jīng)元中均有表達，特別之處在于它在沒有配體的情況下激活Gαs蛋白，從而增加細胞內(nèi)基礎(chǔ)cAMP水平。cAMP的升高可以增強由酶母聚糖、腫瘤調(diào)節(jié)素或神經(jīng)營養(yǎng)因子誘導的軸突再生。因此，細胞內(nèi)cAMP升高對神經(jīng)元存活與生長具有多模式影響并對軸突損傷后神經(jīng)元再生具有重要作用。由于視網(wǎng)膜免疫染色需要強滲透處理，因此，作者利用CRISPR- Cas9基因組編輯技術(shù)生成了PA標記的GPR3轉(zhuǎn)基因小鼠。制備crRNA-tracrRNA復合物，然后將Cas9酶、crRNA-tracrRNA和ssodn以100、200和400 μg/μl的最終濃度混合。使用NEPA 21（NEPA GENE）電轉(zhuǎn)染儀將Cas9酶、gRNA和ssodn的混合物轉(zhuǎn)染到小鼠胚胎中以便觀察GPR3在視網(wǎng)膜上的分布與表達情況。結(jié)果顯示視網(wǎng)膜中，GPR3在RGCs、ONL和INL神經(jīng)元中均表達，在無分泌細胞中表達稀疏。視網(wǎng)膜中GPR3的表達與中樞神經(jīng)細胞中GPR3的表達趨勢相似（圖1）。

圖1、GPR3在小鼠視網(wǎng)膜中具備高表達

為了研究GPR3在RGC存活過程中的作用，通過評估RGCs數(shù)量和內(nèi)網(wǎng)織層（IPL）厚度來確定RGC活力。與野生型小鼠相比，早在10-12周齡時，GPR3敲除小鼠的RGCs數(shù)量和IPL厚度顯著減少。在野生型小鼠中，與10-12周齡相比，50-60周齡時RGCs數(shù)量明顯減少。此外，在50-60周齡的GPR3敲除小鼠中也觀察到RGCs數(shù)量的減少。這些結(jié)果表明，GPR3在RGC中的表達與RGC在衰老過程中的生存有關(guān)，但對眼壓無影響（圖2）。

為了包裝腺相關(guān)病毒（AAV）， PAAV質(zhì)粒、Rep2-Cap2質(zhì)粒和phelper質(zhì)粒使用NEPA21電轉(zhuǎn)染儀(Nepa Gene)共轉(zhuǎn)染HEK293FT細胞，從細胞和培養(yǎng)基中收集包裝好的AAV載體，然后進行純化。為增加載體濃度，將復合材料應(yīng)用于Vivaspin色譜柱(VS2041;感染前1天，HEK293細胞以2.0 × 10⁵個細胞/孔的比例在24孔板中培養(yǎng)，以評估滴度。轉(zhuǎn)染3天后固定細胞，在熒光顯微鏡下計數(shù)gfp陽性細胞，每種AAV的效價分為三份并計算轉(zhuǎn)導單位(TU/ml)，得到本研究使用的AAV病毒滴度:rAAV-Mock 10 × 10¹⁰ TU/ml和rAAV-GPR3 8 × 10¹⁰ TU/ml。為了評估軸突再生，6周齡雄性野生型小鼠(C57BL/6)在ONC前2周使用玻璃拉桿制成的尖尖玻璃毛細管靜脈注射1 μl rAAV-Mock或rAAV-GPR3。為了評估GPR3和酵母聚糖的聯(lián)合作用，在ONC后立即仔細地靜脈注射1 μl酵母聚糖 。陽性對照組在ONC后立即同時注射1 μl 酵母聚糖。摘除眼睛，在去核前兩天，順行示蹤劑以可視化再生的RGC軸突。然后用低溫恒溫器將固定的視網(wǎng)膜矢狀切片成14 μm厚的切片，為了評估再生軸突的數(shù)量，作者在距離粉碎部位4種不同距離處量化再生軸突的數(shù)量。對野生型或GPR3基因敲除小鼠的眼睛進行ONC，手術(shù)后立即在眶內(nèi)給藥酵母聚糖，神經(jīng)損傷后28天用熒光順行示蹤劑評估軸突再生。結(jié)果表明，在野生型小鼠中，酵母聚糖影響軸突再生。然而，在GPR3基因敲除小鼠的視網(wǎng)膜中，酶多糖介導的軸突再生被顯著抑制。當聯(lián)合酵母聚糖時，GPR3在ONC后軸突再生中起作用（圖3）。

圖3、GPR3參與視神經(jīng)擠壓（ONC）后的軸突再生

基于其他報道稱暴露于各種缺血刺激后，GPR3參與CGNs神經(jīng)軸突生長和神經(jīng)元存活。因此，為了確定GPR3表達是否在RGCs的神經(jīng)突生長和神經(jīng)元存活中發(fā)揮類似的作用。RGCs在培養(yǎng)前表現(xiàn)出微弱的GPR3表達;然而，直到培養(yǎng)7天，GPR3的表達逐漸增加(圖4.A-B)，這與原代培養(yǎng)的CGNs中GPR3的表達趨勢相似。當GPR3表達為與對照組相比，siRNA抑制RGCs中GPR3的表達顯著降低(圖2.A).在對照組siRNA處理的RGCs中，神經(jīng)突出增加，直到培養(yǎng)48小時。然而，當GPR3 siRNA抑制了固有的GPR3表達時，RGC神經(jīng)突在培養(yǎng)24或48小時被顯著抑制(圖4.C-D)。此外，與對照組siRNA處理的RGCs相比，在培養(yǎng)24或48小時，GPR3 siRNA處理的RGCs的RGC存活率顯著降低(圖4.G-H)。

相反，當用表達GPR3的載體轉(zhuǎn)染RGCs時，GPR3的表達與模擬載體轉(zhuǎn)染RGCs相比顯著增加。與模擬轉(zhuǎn)染的細胞相比，GPR3表達載體轉(zhuǎn)染的RGCs中的神經(jīng)突顯著增加這些結(jié)果表明，GPR3在培養(yǎng)的RGCs中的表達促進了神經(jīng)突的生長和神經(jīng)元的存活（圖4）。

圖4、GPR3參與小鼠原代培養(yǎng)RGCs的神經(jīng)突起生長和神經(jīng)元存活

作者認為GPR3基因轉(zhuǎn)染到視網(wǎng)膜聯(lián)合酵母聚糖治療可顯著刺激軸突再生，類似于cAMP聯(lián)合酵母聚糖治療后觀察到的情況。cAMP升高對生長因子有增敏作用，并影響PKA-、ERK-和pi3k依賴的信號通路。因此，本研究觀察到GPR3對酵母聚糖的增敏作用可能是通過GPR3下游信號通路介導的。同時，Akt介導的信號通路對軸突再生具有多種影響，下調(diào)SOCS3或PTEN抑制劑可激活PI3K-Akt信號通路，從而增強ONC后的軸突再生。此外，軸突退變受Akt信號的調(diào)控，Akt信號的增強可以抵消多巴胺能軸突的逆行退變。同時CaMKII-CREB信號通路對于ONC后神經(jīng)元存活和軸突再生很重要。因此，損傷后RGCs軸突再生涉及多條信號通路，有趣的是，當GPR3在CGNs中表達時，它可能激活多個下游信號通路。因此，GPR3激活與軸突再生相關(guān)的多條信號通路是視網(wǎng)膜軸突再生的可行機制。此外，GPR3可以在不添加配體的情況下維持cAMP的基礎(chǔ)水平。在目前的研究中，在ONC后4周，GPR3轉(zhuǎn)導細胞的軸突再生比 cAMP聯(lián)合酵母聚糖治療的細胞少。然而，GPR3對ONC后4周以上軸突再生的長期影響尚不清楚。

NEPA 21（NEPA GENE）電轉(zhuǎn)染儀在本研究中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，作者通過CRISPR-Cas9基因組編輯系統(tǒng)并使用NEPA 21電轉(zhuǎn)染儀獲得了PA-GPR3敲入小鼠，采用純合子PA-GPR3轉(zhuǎn)基因小鼠，用抗PA抗體進行視網(wǎng)膜中GPR3表達的免疫染色分析，從而確定了GPR3在視網(wǎng)膜中的分布及表達情況。為了包裝AAV, PAAV質(zhì)粒、Rep2-Cap2質(zhì)粒和phelper質(zhì)粒使用NEPA 21電轉(zhuǎn)染儀共轉(zhuǎn)染HEK293FT細胞，獲取到AAV載體，然后進行濃縮和純化，為后續(xù)的確定軸突再生實驗提供了良好的病毒載體。

艾貝泰生物科技有限公司細胞醫(yī)學部根據(jù)細胞存儲、細胞治療技術(shù)研發(fā)、應(yīng)用研究等不同領(lǐng)域的特點，推出針對性應(yīng)用技術(shù)的細胞治療平臺產(chǎn)品鏈。

原文：

doi. org/10.1016/j.nbd.2022.105811.

參考文獻：

1、Benowitz, L.I., et al., 2017. Reaching the brain: advances in optic nerve regeneration.

Exp. Neurol. 287, 365–373.

2、Boczek, T., et al., 2019. Regulation of neuronal survival and axon growth by a

perinuclear cAMP compartment. J. Neurosci. 39, 5466–5480.

3、Bonne, C., et al., 1998. Free radicals in retinal ischemia. Gen. Pharmacol. 30, 275–280.

4、Buckingham, B.P., et al., 2008. Progressive ganglion cell degeneration precedes neuronal

loss in a mouse model of glaucoma. J. Neurosci. 28, 2735–2744.

5、Cavet, M.E., et al., 2014. Nitric oxide (NO): an emerging target for the treatment of

glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55, 5005–5015.

6、Cheng, H.C., et al., 2011. Akt suppresses retrograde degeneration of dopaminergic axons

by inhibition of macroautophagy. J. Neurosci. 31, 2125–2135.

往期回顧

◆【推薦】i-GONAD技術(shù)，開啟原位基因編輯胚胎的新征程

◆新冠研究前沿！在iPS中利用CRISPRi系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)病毒感染新機制——NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)助力

◆NEPA21——讓Crispr-Cas9基因編輯技術(shù)與類器官培養(yǎng)研究如虎添翼的利器

◆【重磅】電轉(zhuǎn)染應(yīng)用：從外泌體的巨胞飲途徑到細胞內(nèi)給藥系統(tǒng)

◆新應(yīng)用！NEPA21電轉(zhuǎn)儀助力CAR-T細胞療法的安全性探究

◆【NEPA21 技術(shù)文獻】異質(zhì)核核糖核蛋白U (HNRNPU)保護了發(fā)育中的小鼠皮層