1. 如何對污染進行監(jiān)測？

RNA質(zhì)量控制分為三個部分，一是濃度，二是純度，三是完整性。對于基因表達實驗來說，了解物質(zhì)的起始濃度是很重要的。在比較來自不同樣本的結(jié)果時，應使用相同的樣本量。此外，確定材料的起始濃度也可以對后續(xù)的實驗步驟進行優(yōu)化。樣本可能會被蛋白質(zhì)、基因組DNA或其他有機化合物污染。這種污染可能會影響RNA的量化，同時下游應用及其結(jié)果的相關性也可能受到這種污染的影響。基因組DNA、DNA結(jié)合蛋白、酚類化合物或在RNA提取過程中引入的外源性顆粒（如手套中的粉末），已被證明可以抑制下游逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴增步驟。與DNA相比，RNA是一種相對不穩(wěn)定的分子。因此，RNA的完整性是RNA樣本整體質(zhì)量的重要組成部分。為了避免降解，RNA樣本必須小心地保存，或者在非常低的溫度下沉淀或者凍干。

為了比較基因表達數(shù)據(jù)，必須使用可靠的標準化方法。MIQE指南強調(diào)，所提供的實驗數(shù)據(jù)應包括儀器信息、RNA提取方法以及RNA樣本的濃度、純度和完整性。高質(zhì)量的RNA應當避免RNA酶的污染，勤換手套，使用無RNA酶的試劑和耗材，使用專門的無RNA酶設備用于提取，設立PCR前和PCR后的實驗分區(qū)。取樣時盡可能縮短取樣時間，于液氮中快速冷凍，加入適量的裂解緩沖液和RNA保護劑。在RNA提取時，確保組織在裂解過程中是冷凍狀態(tài)，并使用RNA酶抑制劑。提取的RNA在適宜條件下存儲，-80℃可長期保存，避免反復凍融。如何明確用于RT-qPCR檢測的RNA是否合格？接下來給大家詳細介紹一下RNA質(zhì)控的具體方法。

2. 總RNA質(zhì)量控制方法

RNA質(zhì)量控制可以多種方法進行，它們適用性也各不相同。

分光光度計

總RNA可以利用紫外光的強吸附特性使用核酸分光光度計進行定量，但缺陷是這種紫外光譜方法并不能區(qū)分不同類型的核酸，因此常見的污染物如基因組DNA可能會顯著影響測定結(jié)果。為了更精確的RNA定量，污染的基因組DNA必須被DNA酶消化去除。游離核酸也有助于增加在260nm處的吸收，因此可能需要在DNA酶處理后進一步純化總RNA。通過測定樣品的OD值去評估RNA純度，OD260/280在1.9-2.1之間的樣本純度較好，當OD值小于1.9，說明有蛋白質(zhì)殘留，OD值大于2.1說明RNA可能發(fā)生降解。該方法適用于測定總RNA的濃度和純度；然而，這種方法不能提供任何關于RNA完整性相關的信息。

熒光染料測定

另一種評估RNA濃度的高靈敏度方法是測量與RNA結(jié)合并在結(jié)合時發(fā)出選擇性熒光染料的熒光強度，例如RiboGreen®。染色后的樣品可以用熒光計在試管或微孔板上進行定量?；蚪MDNA殘留會影響測定結(jié)果，因此為了更準確的RNA定量，用DNA酶處理是必要的。此外，基于熒光染料的總RNA定量只測量聚合的核酸，而不會檢測到受污染的蛋白質(zhì)和游離的核糖核苷酸。這種敏感的方法對RNA豐度非常低的樣本非常有用。MIQE的RNA定量指南推薦采用基于熒光的檢測方法。然而，它只適用于總RNA的定量，并不能提供關于RNA的純度和完整性的相關信息。

3'：5'完整性分析

以GAPDH作為目標序列的 3'：5'檢測已被提出作為mRNA完整性的替代測量方法。在GAPDH mRNA序列的三個單獨的qPCR檢測中，GAPDH mRNA序列的5'端、中間和3'端區(qū)域均有目標擴增子。所描述的三重檢測使用TaqMan®化學方法進行，每個擴增子均由靶標特異性差異標記的探針檢測。3'：5'比率描述了3'端和5'端的信號強度的比較。這個值反映了mRNA模板的完整性。3'：5'的比值約為1表示mRNA完整性高，而值大于5表示mRNA降解。所獲得的數(shù)據(jù)獨立于核糖體RNA的完整性，并提供了mRNA降解的可量化測量方法。這種分析方法特別適用于在RNA很少時珍貴樣本的分析。

瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳被廣泛應用于核酸片段的定性分析。它是一種基于凝膠的技術，提供基于大小和電荷的核酸分子分離范圍。在RNA電泳過程中，帶負電荷的RNA通過凝膠向陽極遷移。簡單地說，一個RNA分子的長度決定了它的遷移時間。然而，通過分子內(nèi)堿基配對形成RNA的二級結(jié)構可能會延遲遷移，因此，建議在變性條件下進行RNA電泳。在瓊脂糖凝膠上分離的總RNA顯示出*的物種特異性條帶模式。通常，在真核生物中，可以檢測到包含28S和18S核糖體RNA（rRNA）的兩條主要條帶。當28S:18S rRNA比值為2或更高時，我們認為總RNA是高質(zhì)量的。瓊脂糖凝膠電泳相對便宜，容易獲得，然而，由于缺乏標準化和客觀性，MIQE指南不推薦使用瓊脂糖凝膠電泳。此外，瓊脂糖凝膠電泳需要大量寶貴的RNA樣本，涉及危險化學品的處理，并不提供RNA定量的相關信息。

毛細管電泳

毛細管電泳可用于分離和量化RNA樣本。與經(jīng)典的凝膠電泳相比，這種電泳模式顯著減少了不同類型核酸的分離時間以及試劑和樣品的消耗。毛細管電泳可以提供RNA完整性和濃度的分析。RT-qPCR的性能受RNA完整性的影響，而PCR的效率一般不受影響。測定后RIN值大于5的總RNA被認為是質(zhì)量良好，RIN值大于8的被認為是完整的總RNA。不同生物體和特定樣本類型有特定RIN值要求和閾值水平。作為一種方便和客觀的評估RNA數(shù)量和完整性的方法，該方法與MIQE指南理念一致，因此經(jīng)常被推薦用于總RNA質(zhì)量控制。

3. miRNA質(zhì)量控制方法

RNA質(zhì)量的測定也應用于其他方面，如microRNA（miRNA）表達譜分析。傳統(tǒng)的分光光度法不適用于測定這些短的、非編碼的RNA分子的濃度。RNA提取方法對于保留miRNA和小RNA組分是至關重要的。由于miRNA和小RNA的遷移類似于降解的總RNA，高濃度的這些物種類型可能因此產(chǎn)生低于預期的RIN值。RIN閾值的確定可能需要根據(jù)特定的提取方法進行調(diào)整。

4. 總結(jié)

在開展RT-qPCR和轉(zhuǎn)錄組測序等這種通過測定RNA轉(zhuǎn)錄水平來評估基因表達的實驗時，我們需要對樣本的總RNA質(zhì)量進行嚴格把控。通過多種方法的結(jié)合，檢測出可用于下游實驗的RNA，樣本質(zhì)量質(zhì)控通過后，后續(xù)的基因表達分析才是有意義的。