大家好，這里是專(zhuān)注表觀組學(xué)十余年易基因。

本期，我們聚焦DNA羥甲基化。DNA羥甲基化是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的DNA修飾并迅速成為研究熱點(diǎn)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)之前被認(rèn)為是檢測(cè)DNA甲基化“金標(biāo)準(zhǔn)”的重亞硫酸鹽測(cè)序并不能區(qū)分DNA甲基化（5mC）和DNA羥甲基化（5hmC）。易基因聯(lián)合劍橋大學(xué)建立了化學(xué)氧化法結(jié)合重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的測(cè)序技術(shù)（oxidative bisulfite sequencing, oxBS-Seq），該技術(shù)不僅可以精確檢測(cè)DNA甲基化，排除DNA羥甲基化的影響，還可以雙文庫(kù)結(jié)合同時(shí)單堿基分辨率精確檢測(cè)DNA羥甲基化。該方法非常適合用于需要對(duì)DNA甲基化和羥甲基化進(jìn)行區(qū)分的研究測(cè)序分析。

oxBS-Seq技術(shù)原理

近日，西南民族大學(xué)Jincheng Zhong團(tuán)隊(duì)與西藏農(nóng)牧畜牧獸醫(yī)研究所Jinwei Xin團(tuán)隊(duì)利用oxRRBS+RRBS技術(shù)揭示了牦牛下丘腦在神經(jīng)調(diào)節(jié)和髓鞘形成中的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制。該研究成果于2021年9月27日發(fā)表在《FRONT GENET》（IF:4.599）雜志上。

1.背景：

5-甲基胞嘧啶 (5mC) 和 5-羥甲基胞嘧啶 (5hmC) 都是神經(jīng)發(fā)育中重要的表觀遺傳修飾。然而很少有研究在自然高海拔條件下鑒定動(dòng)物大腦區(qū)域的全基因組5mC和5hmC模式。

2.材料和方法：

從Riwoqe耗牛和三江牛（牛）中各選取三只54個(gè)月大的母牛，所選取的母牛在過(guò)去三代中沒(méi)有直接或間接的血緣關(guān)系，在當(dāng)?shù)厮饺宿r(nóng)場(chǎng)以同樣的飲食喂養(yǎng)，耗牛和牛的平均活重為188.3公斤和163.0公斤。在餓一天后進(jìn)行人道處死，解剖后迅速分離大腦、腦干、小腦和下丘腦，從中各收集1 cm³樣本在液氮中快速冷凍并在-80°C下儲(chǔ)存直至RNA和DNA提取。

利用RRBS+oxRRBS技術(shù)鑒定牦牛和牛的大腦、腦干、小腦、下丘腦的基因組5mC和5hmC位點(diǎn)，繪制全基因組DNA甲基化和羥甲基化圖譜，并進(jìn)行DNA甲基化/羥甲基化差異化分析和對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄組的關(guān)聯(lián)分析。

3.結(jié)果：

① RRBS+oxRRBS繪制牦牛和牛的大腦、腦干、小腦和下丘腦DNA甲基化和羥甲基化圖譜

RRBS+oxRRBS測(cè)序單堿基水平檢測(cè)牦牛和牛的大腦、腦干、小腦和下丘腦DNA甲基化和羥甲基化水平，平均CpG位點(diǎn)為3.28M，平均深度大于10X。

FIGURE 1：Global DNA methylation and hydroxymethylation among the samples.

（A） RRBS和oxRRBS文庫(kù)中正鏈和負(fù)鏈修飾位點(diǎn)差異的Violin圖

（B） Fisher精確檢驗(yàn)計(jì)算RRBS和oxRRBS文庫(kù)中羥甲基化水平和p值的Volcano圖

（C） 牦牛編碼基因中的甲基化和羥甲基化分布

（D） 牛編碼基因中的甲基化和羥甲基化分布

② 牦牛和牛的下丘腦和其他大腦區(qū)域5mC和5hmC差異化分析

作者在牦牛和牛大腦區(qū)域的每次成對(duì)比較中確定差異甲基化區(qū)域（DMRs）和差異羥甲基化區(qū)域（DhMRs）。在耗牛和牛的下丘腦中發(fā)現(xiàn)大部分的DMRs和DhMRs，差異主要在于5mC水平下降和5hmC水平升高。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)大多數(shù)DhMRs（牦牛72.9%，牛75.7%）與DMR相對(duì)應(yīng)，表明5mC和5hmC水平在同一位點(diǎn)“升降”。耗牛樣本的大腦、腦干、小腦和下丘腦組織RRBS文庫(kù)的基因DNA修飾水平?jīng)]有明顯差異，而在牛樣本這些組織中發(fā)現(xiàn)顯著差異。因此，作者推測(cè)5mC和5hmC水平的“升降”可能是特定組織或生物過(guò)程中的一種調(diào)節(jié)機(jī)制，并證實(shí)了在未來(lái)研究中同時(shí)研究5mC和5hmC水平的必要性。

FIGURE 2：Identification of DMRs and DhMRs in yak and cattle.

（A）牦牛（上）和牛（下）兩種組織樣本中DMR（藍(lán)）和DhMRs（黃）的數(shù)量比較。

（B）牦牛和牛樣本各組織RRBS文庫(kù)中總甲基化和羥甲基化分布。

（C）對(duì)牦牛DMRs平均甲基化水平的無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分析顯示DMRs與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的GO terms的基因富集相關(guān)聯(lián)。

（D）對(duì)牦牛DhMRs平均羥甲基化水平的無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分析顯示DhMRs與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的GO terms基因富集相關(guān)聯(lián)。

（E）對(duì)牦牛DhMRs相關(guān)基因mRNA水平的無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分析，顯示與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的GO terms基因富集相關(guān)聯(lián)。

③ 轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)牦牛和牛的下丘腦具有特異性基因表達(dá)模式

作者對(duì)相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得22477個(gè)轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本被注釋到GO、KEGG、TrEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)。與其他大腦組織相比，大多數(shù)差異表達(dá)基因(Differentially Expressed Gene,DEG)在下丘腦中發(fā)現(xiàn)，其中64.9%的DEGs在下丘腦中下調(diào)。這一結(jié)果進(jìn)一步表明，5mC和5hmC水平的“升降”主要發(fā)生在CDS和內(nèi)含子區(qū)域，可能對(duì)基因表達(dá)起調(diào)控作用。

FIGURE 3：Identification of DEGs in yak and cattle.

（A）牦牛（藍(lán)色）和牛（黃色）各樣本組織DEGs數(shù)量比較，“NA”表示未比較。

（B）牦牛下丘腦和大腦之間DEGs的GO terms和KEGG通路富集。

（C）牛下丘腦和腦干之間DEGs的GO terms和KEGG通路富集。

④ 牦牛下丘腦中5mC或5hmC調(diào)控的差異表達(dá)基因在神經(jīng)調(diào)節(jié)和髓鞘形成中發(fā)揮作用

作者鑒定出652個(gè)可能受DMR或DhMR調(diào)控的基因，在這些基因中，上調(diào)基因的平均甲基化水平低于下丘腦下調(diào)基因，上調(diào)和下調(diào)的基因組在大腦、腦干和小腦中均顯示出相似的基因表達(dá)水平。表明下丘腦中顯示出不同的基因表達(dá)、DNA甲基化和羥甲基化譜。

在前五個(gè)上調(diào)基因中，PTGDS基因在下丘腦中高度轉(zhuǎn)錄，可能受啟動(dòng)子的hypoDMR調(diào)控。在前五個(gè)下調(diào)基因中，髓鞘堿性蛋白（MBP）在大腦、腦干和小腦中富集，且可能在下丘腦中受啟動(dòng)子和基因的hyperDMR調(diào)控。

FIGURE 4：DEGs associated with DMRs or DhMRs in yak.

（A）與其他腦組織相比，牦牛下丘腦與DMR/DhMR相關(guān)的DEGs平均甲基化和羥甲基化水平，將DEGs分成上調(diào)組和下調(diào)組。

（B）與其他腦組織相比，牦牛下丘腦中上調(diào)基因組的mRNA水平的無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)。

（C）與其他腦組織相比，牦牛下丘腦中下調(diào)基因組的mRNA水平的無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)。

（D）（左）耗牛最上調(diào)基因PTGDS側(cè)翼3000bp的甲基化水平，（右）其中一個(gè)DMR區(qū)域的甲基化水平。

（E）（左）耗牛最下調(diào)基因MBP側(cè)翼3000bp的甲基化水平，（右）其中一個(gè)DMR區(qū)域的甲基化水平。

在牛樣本中，作者鑒定574個(gè)可能受DMR或DhMR調(diào)控的基因，只有16.03%在下丘腦和其他大腦區(qū)域存在差異表達(dá)。此外，與其他組織相比，牦牛下丘腦中前五個(gè)下調(diào)基因在牛下丘腦中也顯示下調(diào)，而牦牛下丘腦中前五個(gè)上調(diào)基因中只有一個(gè)在牛下丘腦中顯示上調(diào)。與髓鞘形成相關(guān)的下調(diào)基因MBP的mRNA水平可以通過(guò)牛下丘腦基因組高甲基化來(lái)調(diào)控。

FIGURE 5：DEGs associated with DMRs or DhMRs in cattle.

（A）牦牛和牛DMRs/DhMRs相關(guān)上調(diào)DEGs和下調(diào)DEGs的重疊。

（B）與其他大腦區(qū)域相比，牦牛和牛下丘腦中前五個(gè)上調(diào)基因和下調(diào)基因的mRNA水平熱圖。

（C）（左）牛的最下調(diào)基因MBP側(cè)翼3000bp的甲基化水平，（右）其中一個(gè)DMR區(qū)域的甲基化水平。

小結(jié)

本研究利用RRBS+oxRRBS技術(shù)發(fā)現(xiàn)牦牛和牛的下丘腦和其他大腦區(qū)域的5mC和5hmC存在顯著差異，鑒定出差異甲基化區(qū)域（DMR）和差異羥甲基化區(qū)域（DhMR），其中大多數(shù)彼此重疊。最后，驗(yàn)證了DMRs和DhMRs調(diào)控的差異表達(dá)基因（DEGs）可能在神經(jīng)調(diào)節(jié)和髓鞘形成中發(fā)揮重要作用?？傊Y(jié)果表明，5mC和5hmC介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控可能廣泛影響下丘腦的發(fā)育及其生物學(xué)功能，有助于提高高海拔條件的生理適應(yīng)性。

本研究利用的RRBS+oxRRBS是易基因的成熟優(yōu)勢(shì)DNA修飾測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)通過(guò)化學(xué)氧化結(jié)合重亞硫酸鹽處理首先將5hmC氧化為5fC，進(jìn)而可被重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換成U，從而排除了5hmC對(duì)5mC的信號(hào)干擾，達(dá)到精確檢測(cè)基因組5mC的目的，具有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)優(yōu)質(zhì)、多組學(xué)分析數(shù)據(jù)精準(zhǔn)等優(yōu)勢(shì)。

參考文獻(xiàn)：

doi.org/10.3389/fgene.2021.592135