背景

目前最廣泛使用于人類和牲畜疫苗的佐劑仍是鋁鹽佐劑。鋁佐劑化合物包括鋁鹽，如磷酸鋁AlPO₄和氫氧化鋁Al(OH)₃，在疫苗佐劑領(lǐng)域中一般稱做“明礬(鋁鹽)”。一般認(rèn)為抗原必須吸附到佐劑的表面上從而提供充分的免疫原性。通常情況下明礬佐劑一方面充當(dāng)免疫系統(tǒng)刺激物，同時(shí)另一方面作為抗原庫(kù)向給予(例如通過(guò)注射)的部位提供持續(xù)性的抗原釋放來(lái)刺激身體中抗體的產(chǎn)生。已知天然形式的鋁佐劑通常稱為凝膠，其為水性介質(zhì)中的顆粒懸浮液。明礬-佐劑化疫苗的儲(chǔ)存和運(yùn)輸是比較特殊的。凍干 (冷凍干燥)通常作為一種用于不同蛋白制劑的長(zhǎng)期儲(chǔ)存的手段。然而,并不能在不對(duì)佐劑的結(jié)構(gòu)造成破壞的情況下冷凍干燥含有鋁鹽佐劑的商用疫苗。冷凍干燥引起佐劑的凝膠結(jié)構(gòu)的崩塌，導(dǎo)致再懸浮于水中時(shí)佐劑鹽的團(tuán)聚和沉淀。一旦出現(xiàn)難以分散的硬沉淀，后果是顯著降低了疫苗的免疫原性即藥效性。

在一項(xiàng)關(guān)于明礬沉降行為的研究中，輝瑞發(fā)現(xiàn)，由于沉降過(guò)程是逐漸變化的，所以了解它們變化的參數(shù)并能夠測(cè)量出這些參數(shù)是很重要的。輝瑞隨后解釋說(shuō)Turbiscan^®(法國(guó)Formulaction)提供了一種分析這些參數(shù)的新方法

介紹

諸如鋁鹽（明礬）等佐劑通常添加到疫苗中以增強(qiáng)其免疫反應(yīng)。這些佐劑可以聚集，然后隨著時(shí)間的推移由于它們的電荷而沉淀。由此產(chǎn)生比較致密的硬沉淀，并且很難再分散。如果隨著儲(chǔ)存時(shí)間的推移這種現(xiàn)象不斷惡化，那么就會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的問題，我們知道：

  • 注射劑量保持不變（當(dāng)硬沉淀出現(xiàn)，聚集物較大且致密，所有活性成分并不會(huì)都能通過(guò)注射器針頭。）

  • 前面也提到免疫原性降低，治療效果也會(huì)降低。

在本文中，我們提出了一種鋁鹽疫苗再分散性能的快速評(píng)估新方法（少于30分鐘）

技術(shù)性

Turbiscan^®技術(shù)基于靜態(tài)多重光散射，發(fā)送光源（880 nm），并在樣品整個(gè)高度上獲取后向散射（BS）和傳輸（T）信號(hào)。通過(guò)在一段時(shí)間內(nèi)以合適的頻率重復(fù)此測(cè)量，儀器能夠監(jiān)測(cè)物理穩(wěn)定性。

常規(guī)方法：SVR（沉降體積比）

大昌華嘉公眾號(hào)之前的文章里面提到，傳統(tǒng)方法是通過(guò)SVR方法在24小時(shí)后確定疫苗沉淀量。SVR是沉降層高度與初始懸浮物高度的比值。SVR值越大（>0.1），懸浮性/再分散性越好，因?yàn)槌练e物越不致密。這一比率可以通過(guò)Turbiscan的反向散射光檢測(cè)器獲得的數(shù)據(jù)中進(jìn)行計(jì)算，如下圖所示。

為了防止免疫原性的喪失，溶液要控制絮凝（通過(guò)改變pH值或離子強(qiáng)度）。這可以讓疫苗形成松散絮狀物的弱粘結(jié)顆粒，并產(chǎn)生易于再分散的低密度沉積物（大量水被截留）。

新方法：Sonset（沉降開始時(shí)間）

盡管SVR方法非?？煽?，但24小時(shí)對(duì)于質(zhì)量控制或日常工作來(lái)說(shuō)仍然太長(zhǎng)。沉降開始時(shí)間（Sonset）似乎更方便，因?yàn)樗捻憫?yīng)速度快（少于30分鐘）。Sonset方法是根據(jù)懸浮液由于沉淀作用上層溶液達(dá)到對(duì)應(yīng)的澄清度（具體保密）的響應(yīng)時(shí)間。

Sonset由傳輸信號(hào)確定，可由軟件一鍵計(jì)算并獲得。

Sonset方法的驗(yàn)證：

為了驗(yàn)證Sonset作為一種新的篩選方法，用不同pH值（3至9）的AlPO4懸浮液、離子強(qiáng)度（0至1000 mMmol NaCl）（含或不含模型抗原（BSA、溶菌酶））測(cè)定24小時(shí)SVR與Sonset之間的關(guān)系。

取20mL懸浮液并加入到Turbiscna專用樣品池中進(jìn)行測(cè)量。每個(gè)數(shù)據(jù)集的收集時(shí)間為24小時(shí)。如上所述，分別從透射和反向散射數(shù)據(jù)中獲得每個(gè)樣品30分鐘后的沉降開始時(shí)間（Sonset）和24小時(shí)后的沉降體積比（SVR）。

而結(jié)果如下（圖3），2段絮凝水平的斜率曲線，可以用來(lái)判斷樣品系統(tǒng)是硬沉淀（陡坡）還是軟沉淀（緩坡）。

1.當(dāng)懸浮液發(fā)生硬沉淀時(shí)（例如：低pH且無(wú)NaCl），AlPO₄仍然是分散顆粒（<3μm），導(dǎo)致沉降速度慢（Sonset>60min），從而防止溶劑在沉積物中滯留。它往往會(huì)壓縮成一個(gè)很硬的沉淀層，很難再分散。SVR值較低（<0.1）也是反映了這一點(diǎn)。

2. 當(dāng)懸浮液發(fā)生軟沉淀時(shí)（中高pH值或/和高離子強(qiáng)度）中，絮凝體的松散結(jié)構(gòu)很難保存在含有大量截留水的沉積物中。最終沉積物的體積相對(duì)較大反映為較大的SVR（>0.1）。沉積速率很高（Sonset<30分鐘），并且強(qiáng)烈依賴于絮凝水平（陡坡）?？刂七@些特性可以保證沉積物的良好再分散，并通過(guò)擴(kuò)展其免疫原性。當(dāng)Sonset值最低，藥效性也最強(qiáng)。

結(jié)論

Turbiscan有助于設(shè)計(jì)適當(dāng)絮凝的明礬配方。通過(guò)改變配方pH值、離子強(qiáng)度和抗原數(shù)量，可以確定有利于絮凝系統(tǒng)的理想條件。使用上述沉降特性化方法（SVR和Sonset）有助于做出決定。Turbiscan分析的Sonset和SVR數(shù)據(jù)可以區(qū)分了AlPO₄配方的沉淀類型。最后，由于分析時(shí)間要短得多，Sonset值可以代替SVR數(shù)據(jù)作為表征懸浮液的再分散性能評(píng)價(jià)的參數(shù)的新方法），更適合配方篩選活動(dòng)。

Turbiscan是一種強(qiáng)大的工具，可用于任何乳劑或分散體，在制藥工業(yè)中有多種應(yīng)用，可用于配方開發(fā)過(guò)程、常規(guī)測(cè)試或質(zhì)量控制中。我們的客戶可以全面和快速表征他們的配方穩(wěn)定性。Turbiscan的一次測(cè)量可以在30秒內(nèi)完成，使用Turbiscan測(cè)量穩(wěn)定性和進(jìn)行貨架期研究比簡(jiǎn)單的視覺分析快200倍。

沉淀現(xiàn)象的Turbiscan數(shù)據(jù)圖