重點與難點

乳膏劑是一種常用于濕疹、皮炎、皰疹等局部皮膚病治療的外用半固體制劑，其基質(zhì)一般由水相和油相兩相組成，藥物則以溶解或混懸狀態(tài)分布于基質(zhì)中，因此被認為是典型的“大簡至繁”的復(fù)雜制劑，即處方組成簡單，但微觀結(jié)構(gòu)復(fù)雜且工藝難點多，包括藥物晶型、混懸的藥物顆粒大小和形貌、油水兩相之間的界面張力、液滴粒徑分布與穩(wěn)定性、流變學(xué)特性等等，其中API和液滴顆粒的粒度分布對生物利用度和制劑物理穩(wěn)定性的影響最為關(guān)鍵，因此是乳膏劑產(chǎn)品開發(fā)和質(zhì)量控制中的重點和難點。

藥物研發(fā)中常用的粒徑測定技術(shù)有多種，包括激光粒度儀、動態(tài)光散射、電鏡、光學(xué)顯微鏡等，但由于乳膏劑的半固體制劑形態(tài)，對其進行顆粒表征的特殊挑戰(zhàn)在于^[1]：

① 在樣品制備時，不能因為稀釋、蒸發(fā)或其他操作導(dǎo)致API/液滴顆粒大小發(fā)生變化；

② 要具有足夠高的對比度，能夠?qū)PI/液滴進行準確計數(shù)和分析，因此光學(xué)顯微鏡成為了乳膏劑顆粒粒度和形貌分析的簡單直接的工具。

用光學(xué)顯微鏡對乳膏劑進行觀察時，通常采用“三明治”制樣法，即取少量樣品于載玻片上，蓋上蓋玻片后輕輕按壓使樣品延展鋪開成為薄薄的一層，這樣盡可能保證API顆粒的微環(huán)境和制劑的微觀結(jié)果不被破壞，避免了采用其他粒徑測定技術(shù)時導(dǎo)致乳膏中API顆粒溶解、析出、重結(jié)晶或乳滴顆粒因剪切力而變形、破裂等問題。

傳統(tǒng)方法的困境

常用于乳膏劑分析的普通光學(xué)顯微鏡包括亮視野顯微鏡和偏光顯微鏡(PLM)，亮視野顯微鏡用于觀察乳膏劑中的液滴顆粒，PLM則用于混懸API晶體顆粒的分析，但這兩種手動模式的顯微鏡觀察法都存在明顯弊端：

① 顆粒代表性不足的問題。普通顯微鏡觀察樣品，通常只能獲得少數(shù)視野中幾十到至多幾百個顆粒的信息，而視野之外還有海量顆粒樣本被遺漏，所以很難通過觀察有限個數(shù)的顆粒樣本得到有統(tǒng)計代表性和可重復(fù)的粒度分布信息。而根據(jù)ISO13322-1: 粒度分析— 靜態(tài)圖像分析法^[2]：“當采用圖像分析法測定粒度時，必須要統(tǒng)計一定數(shù)目的顆粒才能得到有意義的粒度結(jié)果……例如對幾何標準偏差為1.6的粉末顆粒，誤差5%以內(nèi)以及概率為95%時，得到粉末的質(zhì)量中位徑，需要大約61000個顆粒?！?即使乳膏劑的粒度分布相對較窄，未必需要觀察數(shù)以萬計的顆粒，但是如何確保顆粒樣本數(shù)量足夠和粒度統(tǒng)計信息具有代表性，仍然是普通顯微鏡觀察法面臨的最大難題。

② 分析人員主觀性偏差。普通顯微鏡觀察依賴于操作者挑選觀察視野和辨識顆粒，存在較強的主觀偏向性 ，有可能不同的操作者因為判斷標準不一致或長時間觀察的疲勞導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)較大的偏差，所以最好是由經(jīng)驗豐富的、專門的分析人員進行觀察和分析。

由于存在代表性不足、主觀誤差大且效率低下等先天不足，使采用普通顯微鏡測定乳膏劑顆粒粒徑成為了一門“玄學(xué)“，顯然無法滿足FDA外用半固體制劑仿制藥指導(dǎo)原則中所要求的對乳膏劑的微觀結(jié)構(gòu)特性（Q3）進行準確表征以與參比制劑進行相似性評價的要求^[3]。

變“玄學(xué)”為科學(xué)

隨著計算機技術(shù)和高精度微定位控制技術(shù)的發(fā)展，全自動顯微鏡成為了顆粒圖像表征領(lǐng)域的Game Changer。與普通手動顯微鏡相比，全自動顯微鏡具有相同的高分辨率和成像質(zhì)量，并且能夠?qū)θ曇斑M行自動掃描、計數(shù)和成像，不僅解決了傳統(tǒng)顯微鏡法統(tǒng)計代表性不足問題，還將分析效率提升了數(shù)百倍，更好的滿足了藥物研發(fā)對于數(shù)據(jù)準確度、重復(fù)性以及時間效率的高要求。

Morphologi 4是馬爾文帕納科公司的最新一代全自動顆粒圖像分析系統(tǒng)，符合靜態(tài)圖像分析國際技術(shù)標準ISO13322-1, 可對0.5μm到幾個毫米范圍內(nèi)的顆粒進行自動掃描和快速成像，自動統(tǒng)計顆粒數(shù)目和獲得顆粒高清圖像，分析顆粒大小和形貌特征，一次掃描的顆粒數(shù)目可從數(shù)千個到幾十萬個以確保充分的代表性，并給出具有統(tǒng)計意義的顆粒粒度分布和形貌分布信息。

Morphologi 4 適用于不同類型的藥物樣品，除乳膏劑、混懸劑等劑型可以通過“三明治法”制樣進行分析以外，還帶有自動干粉分散裝置，可對原料藥、輔料和膠囊等干粉樣品進行全自動分散和掃描，是對原輔料和制劑進行基于圖像法的量化分析和質(zhì)量控制的利器。

應(yīng)用案例

該案例中的樣品為主藥呈混懸狀態(tài)的半固體制劑，按照藥審中心《皮膚外用化學(xué)仿制藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求^[4]，混懸的藥物粒徑對其在皮膚局部的溶解度和釋放速率有關(guān)鍵影響，而液滴粒徑可反映處方工藝的合理性，并會影響藥物的釋放性能和透皮性能，因此要求對仿制藥的粒徑指標進行研究和控制，作為評價生物等效性的依據(jù)。

采用“三明治”制樣法，通過Morphologi 4自動掃描分析，二十分鐘之內(nèi)即可獲得API顆粒和液滴顆粒的粒徑分布結(jié)果，以及API的晶癖和液滴顆粒的圓度值等形貌因子的分布值。

參考文獻：

[1]. D. W. Osborne, K. Dahl, H. Parikh. Determination of Particle Size and Microstructure in Topical. AAPS Advances in the Pharmaceutical Sciences Series 36

[2]. ISO13322-1: Particle size analysis — Image analysis methods Part 1: Static image analysis methods.

[3]. 邵鵬, 鄭金琪, 潘芳芳等. 外用半固體制劑的體外釋放試驗和等效性評價[J]. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2021, 38(20): 2481-2487。

[4]. 新注冊分類的皮膚外用仿制藥的技術(shù)評價要求，藥品審評中心。