人成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的共培養(yǎng)促進(jìn)缺氧條件下骨橋蛋白的誘導(dǎo)

來源：上海泉眾機(jī)電科技有限公司 2022年05月30日 10:45

腎功能衰竭是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題，發(fā)病率每年都在增加。終末期腎病患者需要腎移植或血液透析才能維持生命。動(dòng)靜脈內(nèi)瘺（AVF）作為血液透析的血管通路。只有 50% 的 AVF 在創(chuàng)建六個(gè)月后仍保持功能，這增加了患者的發(fā)病率和死亡率。一些臨床因素似乎與 AVFs 功能障礙有關(guān)，包括性別、年齡或糖尿病。組織學(xué)上，功能障礙最常見的原因是內(nèi)膜增生（NH），它是狹窄的原因。在 AVF 的 NH 中已經(jīng)確定了不同的機(jī)制，包括成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞增殖和內(nèi)皮細(xì)胞活化。

越來越多的證據(jù)支持 HIF 通路對(duì)影響血管壁的疾?。ò▌?dòng)脈粥樣硬化，動(dòng)脈瘤，肺動(dòng)脈高壓，血管移植失敗，慢性靜脈疾病和血管畸形）的發(fā)病機(jī)制的保護(hù)和破壞作用。此外，VEGF-A（一種 HIF-1α 靶基因）的表達(dá)增加可能通過增加平滑肌細(xì)胞的增殖而促成 NH。最近的一項(xiàng)研究表明，在 AVF 形成過程中降低 VEGF-A 基因表達(dá)會(huì)降低 NH。

骨橋蛋白（OPN）是一種 SIBLING 蛋白（小整合素結(jié)合配體 N 端連接糖蛋白），最初被鑒定為將骨細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)連接起來的骨基質(zhì)蛋白。OPN 有兩種亞型，即分泌型（sOPN）和胞內(nèi)型（iOPN），它們具有不同的生物學(xué)功能。OPN 參與多個(gè)過程，包括組織重塑、細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)、病理性慢性炎癥過程、癌變以及心血管疾病。特別是，已發(fā)現(xiàn)它在人再狹窄性血管病變和狹窄性血管病變的血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)。

活性氧（ROS）和高血糖在胰腺上皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中誘導(dǎo) OPN 的體內(nèi)表達(dá)。盡管已顯示缺氧狀態(tài)時(shí) OPN 的上調(diào)依賴或獨(dú)立于 HIF-1 的調(diào)控，但 OPN 表達(dá)在缺氧條件下通過不同的機(jī)制增強(qiáng)，導(dǎo)致與 VEGF 共表達(dá)。

鑒于氧濃度的變化發(fā)生在 AVF 的手術(shù)創(chuàng)建過程中與 OPN 過表達(dá)同時(shí)發(fā)生，法國蔚藍(lán)海岸大學(xué)、法國尼斯大學(xué)中心醫(yī)院血管外科、摩納哥科學(xué)中心的課題組認(rèn)為 OPN 是由缺氧誘導(dǎo)的，因此可能由于 NH 和近端吻合口狹窄而導(dǎo)致 AVF 成熟失敗。他們假設(shè)通過沉默 HIF 或 NF-kB 來調(diào)節(jié) OPN 可以促進(jìn) AVF 成熟。最后還描述了一種體外共培養(yǎng)細(xì)胞模型，該模型在缺氧條件下誘導(dǎo) OPN，但僅在細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的條件下。

在缺氧細(xì)胞中不誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi) OPN（iOPN）

首先，實(shí)驗(yàn)評(píng)估了 AVF 患者中 OPN 的表達(dá)水平。與對(duì)照靜脈相比，AVF 中 OPN mRNA 的表達(dá)（圖1 A）和 OPN 免疫反應(yīng)性（圖1 B）均顯著增加，證實(shí)了之前的結(jié)果以及 OPN 在 AVF 成熟中的潛在作用。

然后在不同的細(xì)胞模型中通過免疫印跡對(duì) iOPN 進(jìn)行表征。重組 OPN（recOPN）用于定量表達(dá)（圖1 C）。人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨細(xì)胞（圖1 D）和 LNCap 細(xì)胞（圖1 E）作為對(duì)照進(jìn)行檢查，因?yàn)檫@兩個(gè)模型已知表達(dá) OPN。針對(duì) OPN 的抗體檢測(cè)到的 recOPN 濃度為 50 和 16.6 ng，相對(duì)分子量為 70 kDa（圖1 C）。人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞在培養(yǎng) 48 小時(shí)后在常氧環(huán)境中顯示出 iOPN 的高表達(dá)。

由于 iOPN 在 LNCaP 中表達(dá)，評(píng)估了這些細(xì)胞中 iOPN 的潛在缺氧誘導(dǎo)，并觀察到了輕微的誘導(dǎo)（圖1 E）。由于 HIF-1 是細(xì)胞適應(yīng)缺氧的關(guān)鍵蛋白，實(shí)驗(yàn)檢查了 HIF-1 是否參與 iOPN 的誘導(dǎo)。使用 siRNA 沉默 HIF-1α，發(fā)現(xiàn)在沒有 HIF-1α 的情況下，iOPN 表達(dá)仍然存在。只有 OPN 應(yīng)用 siRNA#2 *消除了 iOPN 的表達(dá)。

隨后的實(shí)驗(yàn)是用這種 siRNA 對(duì) OPN 進(jìn)行的。NHF（代表外膜；圖1 F），HUVSMC（代表與彈性纖維相關(guān)的平滑肌細(xì)胞；圖1 G）和 HUVEC（代表內(nèi)皮細(xì)胞；圖1 H），對(duì)構(gòu)成動(dòng)脈和靜脈三層的三個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行了 iOPN 表達(dá)測(cè)試。盡管在缺氧條件下（1% O2 48 小時(shí)）檢測(cè)到 HIF-1α 和 HIF-2α ，但這些細(xì)胞均未表達(dá) iOPN。這些細(xì)胞在常氧或缺氧的 0.2% O₂ 中均不表達(dá) iOPN。用siRNA 轉(zhuǎn)染 NHF（圖1 F）、HUVSMC（圖1 G）和 HUVEC（圖1 H）后，HIF-1α 和/或 HIF-2α 大大減少了這兩個(gè)亞基的數(shù)量，而 HIF-1α 的沉默略微增加了 HIF-2α 的檢測(cè)水平，反之亦然。因此沉默了兩個(gè)亞基來*消除 HIF 的活性。

這些結(jié)果表明在 NHF 中，iOPN 表達(dá)低于 16.6 ng 的可檢測(cè)水平（圖1 C），而在 HUVSMC 和 HUVEC 中弱表達(dá)。

圖1 骨橋蛋白（OPN）在 NHF、HUVSMC 和 HUVEC 中弱表達(dá)，并且在缺氧時(shí)不被誘導(dǎo)。

在缺氧細(xì)胞中不誘導(dǎo)分泌型 OPN（sOPN）

然后，實(shí)驗(yàn)使用 ELISA 測(cè)試了這些細(xì)胞中的 sOPN。使用兩種不同的試劑盒，一種以納克為單位測(cè)量 sOPN（圖2 A），一個(gè)以皮克為單位（圖2 B）。當(dāng)使用 recOPN 作為參考時(shí)，在常氧或缺氧或 H₂O₂ 或葡萄糖等可能誘導(dǎo) OPN 的條件下在納克水平下 NHF、HUVSMC 和 HUVEC 中未檢測(cè)到 sOPN（圖2 A）。

更靈敏的試劑盒檢測(cè)在 NHF 中（圖2 B）、HUVSMC（圖2 C）中檢測(cè)到 sOPN，但不在 HUVEC （圖2 D）。HNF 和 HUVSMC 在常氧環(huán)境中的 sOPN 水平相似，分別為 765 和 1060 pg/mL。SiRNA OPN（siOPN）用作對(duì)照，消除了 OPN 的分泌。然而，沒有已知的增加 OPN 的刺激物在常氧環(huán)境中激活 sOPN。缺氧條件不會(huì)增加 sOPN，并且 HIF-1α 和/或 HIF-2α 的沉默不會(huì)阻止 NHF 和 HUVSMC 中 OPN 的分泌。然而，用特異性抑制劑（IKK2（AS602868）抑制劑，iNF-κB ）會(huì)輕微抑制 NF-κB 活性，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上 OPN 的分泌從 850 pg/mL 降低到 700 pg/mL。

這些結(jié)果證實(shí)了兩種 iOPN 的弱表達(dá)（圖1）和這些細(xì)胞中的 sOPN，并表明在 HUVEC 中未檢測(cè)到 sOPN。實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，這兩種形式在缺氧條件下不會(huì)通過 HIFs 誘導(dǎo)。然而表明 NF-κB 在一定程度上參與了 OPN 的調(diào)控。

圖2 與缺氧相比，在常氧下由 NHF、HUVSMC 和 HUVEC 產(chǎn)生 OPN。

共培養(yǎng)有利于缺氧條件下 OPN 的誘導(dǎo)

最后，鑒于 OPN 和 AVF 之間的潛在聯(lián)系已在小鼠模型的成熟過程早期顯示，其中三層細(xì)胞并列，實(shí)驗(yàn)使用不同的組合共培養(yǎng)細(xì)胞：NHF/HUVSMC、NHF/HUVEC、HUVSMC /HUVEC 和 NHF/HUVSMC/HUVEC（圖3）。NHF、HUVSMC 和 HUVEC 中 OPN 的 mRNA 表達(dá)高于 NHF/HUVSMC、NHF/HUVEC、HUVSMC/HUVEC 和 NHF/HUVSMC/HUVEC 共培養(yǎng)物（圖3 A）。HUVSMC/HUVEC 的共培養(yǎng)明顯增加了 OPN 的表達(dá)水平。然后，與對(duì)照 siRNA 或 siOPN 相比，在 siRNA 不存在或存在的情況下量化了 OPN 在常氧和缺氧中的內(nèi)源性表達(dá)（圖3 B）。暴露于缺氧的 NHF/HUVSMC 和 NHF/HUVEC 的共培養(yǎng)顯示 OPN 表達(dá)增加了兩倍。HUVSMC 和 HUVEC 的細(xì)胞間相互作用顯示出 OPN 的基礎(chǔ)表達(dá)量高，是其他缺氧共培養(yǎng)中 OPN 的 16 倍，而其他共培養(yǎng)物在缺氧時(shí)未發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)。最后，所有細(xì)胞類型一起呈現(xiàn)中間表達(dá)，在常氧條件下四倍誘導(dǎo)，但在缺氧條件下仍然沒有誘導(dǎo)。

因此，使用 ELISA 測(cè)量了不同組合中的 sOPN（圖3 C）。在所有共培養(yǎng)組合中，觀察到缺氧條件下 sOPN 的誘導(dǎo)。此外，與沒有 HUVEC（NHF/HUVSMC，1.5 倍誘導(dǎo)）的組合相比，HUVEC 與 NHF（2.3 倍誘導(dǎo)）、HUVSMC（2.7 倍誘導(dǎo)）或 NHF/HUVSMC（2.4 倍誘導(dǎo)）的組合似乎在缺氧時(shí)刺激更多的 sOPN 誘導(dǎo)（NHF）。最后，發(fā)現(xiàn) OPN 下調(diào)不會(huì)改變 NHF、HUVSMC 和 HUVEC 的細(xì)胞增殖，而重組人 OPN 只會(huì)增加 HUVEC 增殖（圖3 D），表明 HUVEC 細(xì)胞對(duì) OPN 敏感并且可以直接促成病理性 NH 的發(fā)生。

這些結(jié)果強(qiáng)烈表明，在沒有細(xì)胞間相互作用的情況下，OPN 表達(dá)不會(huì)在缺氧條件下被誘導(dǎo)。此外，不表達(dá) OPN 的 HUVEC 細(xì)胞是 NH 過程的核心。

圖3 共培養(yǎng)在缺氧條件下誘導(dǎo) OPN 表達(dá)。

總之該研究表明，在 AVF 成熟期間發(fā)生的氧合變化可能通過內(nèi)皮細(xì)胞或至少通過形成 AVF 的不同細(xì)胞層的細(xì)胞間相互作用上調(diào) OPN 的分泌，進(jìn)而增加炎癥并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。

參考文獻(xiàn)：Sadaghianloo N, Contenti J, Dufies M, Parola J, Rouleau M, Lee S, Peyron JF, Fabbri L, Hassen-Khodja R, Pouysségur J, Bost F, Jean-Baptiste E, Dardik A, Mazure NM. Co-culture of human fibroblasts, smooth muscle and endothelial cells promotes osteopontin induction in hypoxia. J Cell Mol Med. 2020 Mar;24(5):2931-2941. doi: 10.1111/jcmm.14905. Epub 2020 Feb 7. PMID: 32032472; PMCID: PMC7077551.

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