放射療法廣泛用于癌癥治療，目前技術(shù)朝著以更少的分割提供更高劑量發(fā)展，但這可能會引起細(xì)胞和微血管損傷。微血管系統(tǒng)可能是放療早期應(yīng)答的功能生物標(biāo)志物，然而很難直接且非侵入地測量微血管應(yīng)答情況，其時間進(jìn)程、劑量依賴性和在腫瘤控制中的總體重要性也尚不清楚。針對這種情況，加拿大研究人員Valentin Demidov等使用功能性O(shè)CT，結(jié)合人腫瘤異種移植物臨床前模型，對單次10、20和30 Gy放射劑量下腫瘤的微血管應(yīng)答情況進(jìn)行了體內(nèi)縱向定量成像研究，對放療后血管重塑進(jìn)行了詳細(xì)評估。定量評估了微血管對放療的即時（幾分鐘至幾十分鐘）和早期（幾天至幾周）應(yīng)答、腫瘤體積及熒光強(qiáng)度，與文獻(xiàn)報道過的理論模型進(jìn)行了比較討論，發(fā)現(xiàn)這些放療應(yīng)答雖穩(wěn)定但很復(fù)雜，且隨時間呈劑量依賴性。該研究成果以“Preclinical longitudinal imaging of tumor microvascular radiobiologicalresponse with functional optical coherence tomography”為題發(fā)表于SCIENTIfIC REPORTS。

  背景

 放射療法（radiation therapy, RT）廣泛應(yīng)用于癌癥治療中。靶向腫瘤癌細(xì)胞的常見臨床劑量為每分割2 Gy，每天給藥，持續(xù)5-6周，總累積劑量為50-70 Gy，目前認(rèn)為這種分割方案是臨床xiaoguozuihao的。放射治療傳遞和放射生物學(xué)腫瘤效應(yīng)監(jiān)測方面取得的成果促進(jìn)了立體定向放射療法（stereotactic body radiation therapy, SBRT）的發(fā)展，該療法能以更少分割及每分割更高劑量來提高對腫瘤內(nèi)的局部控制，并降低對周圍正常組織的損傷。

 有臨床前研究證明，較高劑量的輻射能通過腫瘤微血管損介導(dǎo)的“非經(jīng)典”放射生物學(xué)機(jī)制，誘導(dǎo)更多腫瘤細(xì)胞死亡。具體來說，F(xiàn)uks和Kolesnick認(rèn)為這種抗腫瘤能力的提升歸因于血管損傷，且需要的最小閾值劑量為約8-10 Gy。同樣，接受高劑量放療的腫瘤反應(yīng)高于現(xiàn)有的生物學(xué)模型預(yù)測的水平。這可能與腫瘤中活躍的血管新生有關(guān)，血管新生過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖速率顯著增加，可能使腫瘤脈管系統(tǒng)對電離輻射更加敏感。據(jù)報道，腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞的死亡會啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生缺氧、酸性和營養(yǎng)缺乏的微環(huán)境，會使輻射的毒性增強(qiáng)。

 盡管進(jìn)行了大量研究，但大劑量放療后的腫瘤應(yīng)答的潛在生物學(xué)機(jī)制仍不明確。對于放療后不同階段的血管變化動力學(xué)、腫瘤血管的組織性、血管生成和新血管形成情況也知之甚少。主要還是因?yàn)闊o法從毛細(xì)管水平對這些動力學(xué)應(yīng)答進(jìn)行原位研究。結(jié)合針對40多項(xiàng)臨床前研究的綜述發(fā)現(xiàn)，放療微血管應(yīng)答方面缺乏實(shí)驗(yàn)共識，不同實(shí)驗(yàn)方案（動物模型、細(xì)胞系、x射線能量、劑量水平）、不同成像和定量技術(shù)（離體免疫組化、多普勒超聲和體內(nèi)計算機(jī)斷層掃描等）得到的數(shù)據(jù)相互矛盾。雖然針對放療血管應(yīng)答效果提出了幾個理論上的機(jī)制模型，但幾乎沒有直接的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)能來支持和驗(yàn)證這些模型。了解腫瘤微脈管系統(tǒng)對放療的應(yīng)答機(jī)制，不但有可能實(shí)現(xiàn)個性化放療，同時還有助于幫助改善SBRT等更大程度涉及腫瘤微脈管系統(tǒng)的高劑量的放療方法的應(yīng)用。

 已知腫瘤毛細(xì)血管對輻射特別敏感，但大多數(shù)成像方式（超聲、磁共振成像、共聚焦熒光顯微鏡等）的分辨能力達(dá)不到要求，或需造影劑才能實(shí)現(xiàn)可視化及縱向監(jiān)測其反應(yīng)。本研究利用功能性光學(xué)相干斷層掃描（OCT）來研究腫瘤微脈管系統(tǒng)對放射治療的應(yīng)答。OCT是一種無標(biāo)記無創(chuàng)3D光學(xué)成像方式，用于活體觀察皮下組織細(xì)節(jié)，并能在微循環(huán)水平觀察血流細(xì)節(jié)。OCT還具有很強(qiáng)的擴(kuò)展性，如散斑方差光學(xué)相干斷層掃描（svOCT），能夠?qū)铙w微血管進(jìn)行三維深度分辨成像。svOCT圖像的內(nèi)源性對比度源于血管內(nèi)的血液和周圍“固體”組織之間不同的光散射特性。在放療后跟蹤檢測腫瘤脈管系統(tǒng)時，svOCT不需要造影劑，且掃描時間短（幾秒至幾分鐘，取決于腫瘤大?。?、處理速度快、成像深度好（1-3mm，取決于組織和腫瘤類型）、不受血流或血管方向影響。另外OCT掃描儀現(xiàn)在相對便宜，又便攜。

 本研究建立在十年背景工作的基礎(chǔ)上。最初Mariampillai等人開發(fā)了用于微血管監(jiān)測的svOCT方法。Leung等人設(shè)計了加熱式動物固定器。Maeda等人優(yōu)化了背部皮膚窗室（dorsal skin window chamber, DSWC）模型，并對單次30 Gy劑量放射療法的短期反應(yīng)（2周）進(jìn)行了初步研究。Conroy等人開發(fā)了利用生物計量學(xué)進(jìn)行脈管系統(tǒng)量化的后處理技術(shù)。本研究在過去十年經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，從根本上改進(jìn)和完善了成像和分析平臺的方方面面，使得它能夠識別血管放射生物學(xué)反應(yīng)。

 選擇NOD-Rag1^nullIL2rγ^null（NRG）小鼠品系進(jìn)行本研究，它具有抗輻射和免疫缺陷的特性。使用Bx-PC3人胰腺癌細(xì)胞研究其對輻射的反應(yīng)。選擇管體積密度（vascular volume density, VVD）作為微血管度量標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)樗嬎愫唵危ㄑ芟袼氐臄?shù)量除以選定體積中的總像素）、穩(wěn)定性好、受操作員影響最小且結(jié)果復(fù)制方便。還進(jìn)行了兩項(xiàng)與脈管系統(tǒng)無關(guān)的測量來跟蹤放療：每次svOCT成像后，用卡尺測量腫瘤體積并使用熒光顯微鏡測量腫瘤細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。切除放療后的腫瘤，進(jìn)行組織學(xué)染色和組織病理學(xué)評估，以支持和驗(yàn)證體內(nèi)縱向觀察結(jié)果。



 

圖1 （a）攜帶BX-PC3腫瘤的NRG小鼠。背部在DSWC安裝前被剃光。（b）DSWC安裝過程中生長的腫瘤。（c）安裝了DSWC的小鼠。（d）DSWC安裝后9周并放射治療后7.5周（單劑量20 Gy）的小鼠。（e）將NRG小鼠置于小動物輻照器中。225kVp x光從底部入射。（f）DSWC內(nèi)的腫瘤圖像。（g）在10 Gy單劑量放療后，腫瘤顏色發(fā)生變化。




 

圖2 實(shí)驗(yàn)時間進(jìn)程。在Day-28，將腫瘤細(xì)胞注射到背部皮膚中。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到3-5 mm后植入DSWC。植入后約10天對腫瘤進(jìn)行照射（Day 0，標(biāo)記為“R”）。放射后，立即檢測90 min內(nèi)的腫瘤脈管系統(tǒng)。在放射后的5至8周內(nèi)，用卡尺測量（腫瘤體積）、svOCT成像（脈管系統(tǒng)）和表熒光顯微鏡成像（癌細(xì)胞熒光）重復(fù)監(jiān)測腫瘤變化。選擇幾只動物在放療后進(jìn)行腫瘤切除并進(jìn)行組織學(xué)染色，以支持和驗(yàn)證體內(nèi)觀察結(jié)果。（b）腫瘤背面圖。（c）腫瘤正面圖。（d）svOCT微血管圖（c中黑色虛線框）。（e）腫瘤細(xì)胞Ds-Red熒光圖像。

 

圖3 swept-source OCT系統(tǒng)裝置示意圖。SOA：半導(dǎo)體光放大器；PC：偏振控制器；A：光纖衰減器；DB：雙平衡光電探測器；DAQ：數(shù)據(jù)采集卡；C：準(zhǔn)直器；MZ干涉儀：馬赫-曾德爾干涉儀；L：透鏡；M：鏡子；SG：掃描振鏡；CR：環(huán)行器。

 

圖4 通過svOCT實(shí)時成像的腫瘤微脈管系統(tǒng)。（a）DSWC中的腫瘤組織。（b）6 × 6mm²視野的OCT體積式圖像。（c）同一位置的8次連續(xù)B-scan，用于svOCT分析所需的的frame間比較。（d）進(jìn)行frame間像素紋理比較的算法。（e）使用svOCT算法獲得的SV_zx血管橫截面。（f）血管en-face二維投影。（g）深度編碼的血管en-face二維投影。（h）b圖組織中深度編碼的血管。
 

結(jié)果

 01-放射前腫瘤的脈管系統(tǒng)生長情況

 如圖5所示，皮下注射腫瘤細(xì)胞后約2周內(nèi)，腫瘤脈管系統(tǒng)侵襲性地活躍發(fā)展。注射后第3天，鄰近正常組織中出現(xiàn)微血管生長（圖5a），一周后形成爪狀（圖5b），約第10天形成連接（圖5c），隨后更多的新血管在腫瘤內(nèi)迅速發(fā)芽，并在幾天內(nèi)達(dá)到*的脈管化（圖5d）。腫瘤中血管床的結(jié)構(gòu)與正常組織中的有明顯不同，正常組織中血管床結(jié)構(gòu)分級更明確（圖5e），且血管分布更有序、更均勻，以使?fàn)I養(yǎng)物和氧氣能充分灌注到所有細(xì)胞中。相反腫瘤血管不成熟、彎彎曲曲、直徑不規(guī)則、還經(jīng)常有嚴(yán)重彎曲，形成一個沒有層次的混亂迷宮，無法清楚識別其中的小動脈、毛細(xì)血管和小靜脈。



 

圖5 皮下注射癌細(xì)胞后16天內(nèi)BX-PC3胰腺腫瘤的脈管系統(tǒng)發(fā)育情況。（a）注射后3天；（b）7天；（c）10天；（d）16天。（e）用于比較的健康組織脈管系統(tǒng)。

  02-放射治療后的腫瘤生長動力學(xué)變化

 已知對人腫瘤異體移植模型進(jìn)行單次高劑量照射會造成血管的快速改變。圖6中深度編碼的svOCT證實(shí)了10 Gy放射后微血管的這種即刻反應(yīng)。放療半小時后，血管體積密度顯著降低了26%（圖6a, b）。小血管（直徑10-30 μm）反應(yīng)最大，中小血管（直徑30-70 μm）受影響較小。

 但多數(shù)血管密度改變似乎是非yongjiu性的。在放療后45 min和60 min都檢測到微循環(huán)恢復(fù)（圖6c，d），并且在90 min恢復(fù)到初始血管的90%（圖6e）。這可能是放射后暫時性微血管血栓形成或毛細(xì)血管與旁路合流造成的，換句話說，那些在放療后較晚時間點(diǎn)重新出現(xiàn)的血管并沒有因?yàn)榉暖煻鴜ongjiu受損。約10%的血管yongjiu消失，可能是由于放射誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞死亡，以及血漿蛋白外滲引起的間質(zhì)液壓力升高，導(dǎo)致脆弱的腫瘤血管塌陷。



 

圖6 單次10 Gy劑量放療后，1.5h內(nèi)的腫瘤微血管應(yīng)答。（a）放射前；（b）放射后30 min；（c）45 min；（d）60 min；（e）90 min。圖下方數(shù)字為放射后血管體積密度與放射前密度的比率。

圖7為6周內(nèi)（放療前1周至放療后5周），單次20 Gy劑量放療對腫瘤微血管的影響。腫瘤*血管形成后進(jìn)行放射（Day-0），放射后1.5 h觀察到初始反應(yīng)（Day+0），血管密度為放射前的83%。放療后t = 2、6、8天與腫瘤邊緣的血管相比，腫瘤核心的血管更容易受到影響。這支持了以前的推測，即腫瘤周圍的部分血管網(wǎng)約等于正常血管，是由組織正常血管出芽繼續(xù)向腫瘤內(nèi)發(fā)生形成的，與腫瘤核心區(qū)血管形成產(chǎn)生的新腫瘤血管相比，這些血管可能更耐輻射。

 約10天以上的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明，腫瘤會通過存活血管的生長來重新構(gòu)建其脈管系統(tǒng)，這與早期的研究和假設(shè)一致，即局部照射后腫瘤的再生長依賴于存活下來的內(nèi)皮細(xì)胞生成的血管。此外在10天以上的血管重建過程中，腫瘤區(qū)域似乎也變得越來越小。



 

圖7 腫瘤脈管系統(tǒng)對單次20 Gy劑量放射的應(yīng)答。Day-0圖像在放療前1 h拍攝，Day+0為放療后1.5 h。對腫瘤脈管系統(tǒng)的最大抑制約在第8天。
 

除以上成果外，本研究中的svOCT平臺的真正價值在于其巨大的成像吞吐量能力和可量化度量的提取。因此，對整個動物研究（n=60）進(jìn)行了定量總結(jié)，對應(yīng)三個放射劑量水平（再加上未放射的對照），三個測量變量的應(yīng)答情況：從svOCT圖像中提取的腫瘤VVD（圖8a）、通過卡尺測量獲得的腫瘤體積（圖8b）、通過顯微鏡獲得的熒光強(qiáng)度（圖8c）。

 縱向監(jiān)測了約10周，從中總結(jié)出幾個較為明顯的變化趨勢：

• 放射會抑制血管密度（可抑制達(dá)放射后2-4周）；

• 抑制程度隨劑量水平而增加（10 Gy后2周下降約10%，30 Gy后4周下降約70%）；這種減少是暫時的（因此單劑量不足以yongjiu控制腫瘤），最終血管密度恢復(fù)到放射前的水平；

• 血管密度恢復(fù)到放射前水平的時間隨劑量增加而增加（10 Gy約3.5周，30 Gy時8周以上）；

• 放射后1.5 h內(nèi)，高放射劑量組中腫瘤微血管的應(yīng)答更明顯（30 Gy后23%的微血管顯示暫時關(guān)閉，而10 Gy后為10%）。大多數(shù)為直徑小于30 μm的微血管；

• 對比接受放射的三組及未放射的對照組，計算組間是否確實(shí)有差異。對于t >1.5周，確定有差異，P值在0.0001-0.01范圍內(nèi)。對于從照射剛剛結(jié)束到1-1.5周，情況不明確，P值在0.03-0.15范圍內(nèi)（10 Gy到0 Gy組間最大P值出現(xiàn)在t < 1周時）。因此得出結(jié)論，微血管應(yīng)答差異隨劑量的增加而增加，且需要約1-1.5周才能明確顯示出來。
  
   

腫瘤體積對不同劑量的應(yīng)答變化（圖8b）也展示出復(fù)雜的動力學(xué)，其整體對劑量的依賴性與血管密度有些相似，時間反應(yīng)總體上比微脈管系統(tǒng)慢。放射后4-5周腫瘤達(dá)zuidachegndu的收縮（最小腫瘤體積），與劑量水平無關(guān)。與VVD相似，腫瘤收縮程度的最大值隨劑量而增加（10 Gy為20%，30 Gy為80%），并且恢復(fù)到初始體積的時間也呈劑量依賴性（10 Gy為5.5周，20 Gy為8周，30 Gy為8周以上超出實(shí)驗(yàn)觀察時間）。此外在照射后1.5-3周的早期生長抑制情況較復(fù)雜，早期無明顯收縮，隨后腫瘤體積迅速加速減少，在4-5周達(dá)最小，然后恢復(fù)。因此未來非常有必要在其他腫瘤模型中對此進(jìn)行檢查驗(yàn)證。

 已知腫瘤DsRed熒光強(qiáng)度可代表癌細(xì)胞活力水平，并能用于間接測量腫瘤中低氧細(xì)胞比例。圖8c為三種劑量下該度量的應(yīng)答曲線，同樣，曲線總體形狀與VVD和腫瘤體積曲線類似，顯著不同的是在放射后很早期熒光強(qiáng)度急劇下降。具體而言，放療后一天內(nèi)，腫瘤細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著下降（10 Gy下降14%，20 Gy下降30%，30 Gy下降48%）。隨后1-2周略微增加，隨后是另一次下降（10 Gyzuidi點(diǎn)在3周達(dá)85%；20 Gy在4周達(dá)60%；30 Gy在5周達(dá)30%）。隨后的恢復(fù)時間也呈劑量依賴性：4周（10 Gy）、6.5周（20 Gy）和7.5周以上（30 Gy）。

 圖8d為單次20 Gy劑量時，三個度量的應(yīng)答變化情況，以更好地理解和解釋其間的關(guān)聯(lián)。放射后不久，腫瘤細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯下降，伴隨腫瘤毛細(xì)血管和小血管塌陷，隨后脈管系統(tǒng)在頭兩天內(nèi)部分恢復(fù)。腫瘤細(xì)胞殺傷（直接細(xì)胞損傷和脈管誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡結(jié)合）導(dǎo)致腫瘤生長停滯，腫瘤在最初的10天內(nèi)尺寸逐漸減小。對于脈管誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡機(jī)制，在20世紀(jì)80年代有人指出，一個內(nèi)皮細(xì)胞可對應(yīng)一塊含多達(dá)2000個腫瘤細(xì)胞的腫瘤部分，因此一個內(nèi)皮元件的崩潰可能導(dǎo)致沿著失效血管的腫瘤細(xì)胞死亡雪崩。如結(jié)果所示，與腫瘤體積相比，VVD響應(yīng)在時間和幅度上領(lǐng)xian。隨著腫瘤收縮VVD呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)，更多的癌細(xì)胞獲得氧氣和營養(yǎng)，這可能是腫瘤暫時復(fù)發(fā)（t~2周）的原因。盡管存在短暫的體積增加趨勢，但血管數(shù)量繼續(xù)減少，可能導(dǎo)致局部缺氧（腫瘤熒光曲線），并導(dǎo)致放療后第4周腫瘤顯著收縮至原始大小的45%。放療后約2周，通過存活血管的生長開始腫瘤再血管化。隨著血管開始再生長并從周圍組織萌出進(jìn)入腫瘤（圖6，第13-35天），腫瘤熒光強(qiáng)度也開始增加（延遲幾天）。幾天后，腫瘤停止收縮，隨后在7.5周*再生。

 圖8e為Kozin等人于2012年提出的放射生物學(xué)理論模型，基于迄今為止不同的（并且經(jīng)常是相互矛盾的）放射的組織研究報告。盡管數(shù)據(jù)不是最佳的，但作者確實(shí)提出了單次高劑量放射后微血管動力學(xué)的所謂機(jī)制，包括腫瘤體積收縮和隨后再生長。理論上預(yù)測的腫瘤體積曲線的總體形狀與我們研究的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)非常一致。



 

圖8 單次10、20和30 Gy劑量局部放射后，通過血管體積密度（VVD）、腫瘤體積和熒光強(qiáng)度的變化反映出的腫瘤發(fā)展動力學(xué)。（a）腫瘤微血管應(yīng)答。（b）腫瘤體積應(yīng)答。（c）腫瘤熒光應(yīng)答。未受照射的腫瘤（0 Gy數(shù)據(jù)）因生長過大無法顯示所有數(shù)據(jù)。（d）20 Gy單劑量輻照的VVD、體積和熒光應(yīng)答的總結(jié)圖表。（e）文獻(xiàn)提出的腫瘤生長和20 Gy單劑量照射后微血管相應(yīng)變化的模型。

圖9為對照組和三個放射組（10、20和30 Gy）腫瘤區(qū)域的H&E染色和TUNEL染色。腫瘤細(xì)胞在放射前處于活躍增殖狀態(tài)（TUNEL），有許多中小血管（H&E）（圖9a）。10 Gy放射后兩周（圖9b），主要是基質(zhì)細(xì)胞受到影響，16%的癌細(xì)胞發(fā)生凋亡（TUNEL）。20 Gy放射后2周（圖9c），癌癥和基質(zhì)細(xì)胞中度損傷（48%）。30 Gy放療后2周（圖9d），腫瘤核心基質(zhì)細(xì)胞和癌細(xì)胞幾乎*損傷（98%）（TUNEL）。與腫瘤體內(nèi)動力學(xué)相似，這些組織學(xué)結(jié)果進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了劑量水平和放療后經(jīng)過的時間在腫瘤放射生物學(xué)反應(yīng)的復(fù)雜軌跡中的重要性。



 

圖9 H&E（上排）和TUNEL（下排）染色圖片。（a） 0 Gy放射；（b）10Gy；（c）20Gy；（d）30Gy。放療后2周切除腫瘤。整個腫瘤切片中TUNEL陽性率分別為0.3%、15.8%、47.6%和97.7%。

 

結(jié)論
 

本研究展示了體內(nèi)異種移植人胰腺腫瘤對三種不同放射劑量水平的應(yīng)答結(jié)果，在放射后進(jìn)行了長達(dá)8周的無創(chuàng)成像。開發(fā)、完善并驗(yàn)證了一種專門用于該研究的功能性O(shè)CT微血管成像和量化平臺。通過該平臺收集了體內(nèi)測量數(shù)據(jù)，包括腫瘤大小和熒光，以補(bǔ)充獲得的微血管信息，并與已有的放射生物學(xué)模型進(jìn)行了比較。作為度量標(biāo)準(zhǔn)，血管體積密度易于計算，且結(jié)果可靠，適合用于反映腫瘤微血管對輻射的應(yīng)答。這些成果非常有參考價值，未來我們需要檢查它在其他臨床前體內(nèi)模型中的可推廣性，探索分級（多劑量治療）的效果，并進(jìn)一步將基于OCT的放射治療監(jiān)測平臺擴(kuò)展臨床試驗(yàn)研究中，實(shí)現(xiàn)對患者進(jìn)行微血管放射治療監(jiān)測。

參考文獻(xiàn)：

Demidov, Valentin , et al. "Preclinical longitudinal imaging of tumor microvascular radiobiological response with functional optical coherence tomography." Scientific Reports 8.1(2018):38.