五種致瀉性大腸埃希氏菌鑒定試劑盒（PCR法）說(shuō)明書(shū)

u  產(chǎn)品說(shuō)明

五種致瀉性大腸埃希氏菌鑒定試劑盒PCR法可針對(duì)食品、飼料等樣品中的致病微生物的特異核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增過(guò)程中的熒光信號(hào)變化，自動(dòng)判讀結(jié)果。本產(chǎn)品用于致瀉大腸埃希氏菌的檢測(cè)。檢出限為 103 CFU/ml。

◆    產(chǎn)品組成（96 測(cè)試）

◆   所需儀器

ABI ，BioRad，TaKaRa 等 PCR 擴(kuò)增儀，電泳儀，凝膠成像儀等電泳配套設(shè)備。（使用熒光定量 PCR 儀進(jìn)行定性判讀時(shí)則無(wú)需電泳設(shè)備）

◆   自備耗材和儀器

①滅菌 1.5mL 或 2.0mL 離心管；②冰盒；③移液器（0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭；④ 離心機(jī)；⑤渦旋混勻器；⑥金屬浴。

◆   樣品處理

參照《GB4789.6—2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)》中的操作步驟進(jìn)行前增菌。建議使用試劑配套細(xì)菌基因組 DNA 提取系列產(chǎn)品。

◆   實(shí)驗(yàn)操作

1.試劑配制（試劑配制區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）取出各管試劑，將試劑*解凍，離心 30s。取 12×(所待檢樣品數(shù)+3)的 PCR 反應(yīng)管，按 12 個(gè)一組排列并編號(hào)，依次向各管中加入 23μL 的 12 種反應(yīng)液。

2.添加模板（樣本制備區(qū)，放置于冰盒中進(jìn)行）向每管反應(yīng)液中分別加入 2μL 模板（或直接使用無(wú)菌吸頭挑取少許待檢菌落至反應(yīng)管中）。加樣示例：（有 N 個(gè)待測(cè)樣品）

取(N+3)組 12 個(gè)一組的反應(yīng)管，按順序第一組 12 管中全部加入 2μL 的 NG-DW，第二組 12管中全部加入 2μL的 NG-Ecoli，第三組 12 管中全部加入 2μL 的樣品 1 模板，第四組 12 管中全部加入 2μL 的樣品 2 模板，…，最后組 12 管中全部加入 2μL 的PG-Ecoli。

蓋好 PCR 管蓋后，渦旋混勻 30s，離心 1min，立即進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。

3.擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）

按下列條件設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)：（如需使用熒光法進(jìn)行檢測(cè)請(qǐng)選擇 FAM 通道）

4.產(chǎn)物電泳（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）

稱量 4. 0g 瓊脂糖粉，加入至 200 mL 的 1×TAE 電泳緩沖液中，充分混勻。使用微波爐反復(fù)加熱至沸騰，直到瓊脂糖粉*融化形成清亮透明的溶液。待瓊脂糖溶液冷卻至 60℃右時(shí)，加入溴化乙錠( EB )至終濃度為 0.5μg/mL， 充分混勻后，輕輕倒入已放置好梳子的模具中，凝膠長(zhǎng)度要大于 10cm，厚度宜為 3mm~5mm。檢查梳齒下或梳齒間有無(wú)氣泡，用一次性吸頭小心排掉瓊脂糖凝膠中的氣泡。當(dāng)瓊脂糖凝膠*凝結(jié)硬化后,輕輕拔出梳子，小心將膠塊和膠床放入電泳槽中，樣品孔放置在陰。向電泳槽中加入 1×TAE 電泳緩沖液，液面高于膠面 1mm~2mm。將5μL PCR 產(chǎn)物與 1μL 6×上樣緩沖液混勻后，用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下膠孔，小心上樣于孔中；陽(yáng)性對(duì)照的 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物加入到最后一個(gè)泳道;第一個(gè)泳道中加入 2 μ L 分子量 Marker 。接通電泳儀電源，根據(jù)公式： 電壓=電泳槽正負(fù)極間的距離（cm）×5V/cm 計(jì)算并設(shè)定電泳儀電壓數(shù)值；啟動(dòng)電壓開(kāi)關(guān)，電泳開(kāi)始以正負(fù)極鉑金絲出現(xiàn)氣泡為準(zhǔn)。電泳 30min~45min 后，切斷電源。取出凝膠放入凝膠成像儀中觀察結(jié)果，拍照并記錄數(shù)據(jù)。

u  可使用 Gold view、Gal-Rad 等等效的核酸熒光染料替代 EB。

u  推薦使用 DNA Marker：DL2000 或 100bp ladder，等可指示 100bp~1500bp 條帶的 Marker。

◆    結(jié)果分析

1.陰陽(yáng)性判讀：

進(jìn)行電泳檢測(cè)時(shí)，需對(duì)比 Marker 進(jìn)行判斷，當(dāng)目的靶標(biāo)對(duì)應(yīng)位置出現(xiàn)單一顯著條帶時(shí)可判斷該靶標(biāo)為陽(yáng)性； 否則為該靶標(biāo)檢測(cè)為陰性。（使用熒光定量 PCR 儀檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)孔Ct≤30 時(shí)判斷該孔為陽(yáng)性；當(dāng)檢測(cè)孔Ct＞30 時(shí)， 該檢測(cè)孔為陰性）

示例電泳圖

2.有效性判讀：

需同時(shí)滿足：1.空白對(duì)照中所有泳道均為陰性；2.陰性對(duì)照中 uidA 泳道陽(yáng)性，其余泳道陰性；2.陽(yáng)性對(duì)照中所有泳道陽(yáng)性，此時(shí)可判斷實(shí)驗(yàn)有效。如無(wú)法滿足上述條件，則實(shí)驗(yàn)無(wú)效，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)；如重復(fù)后結(jié)果仍為無(wú)效，請(qǐng)于本公司技術(shù)支持聯(lián)系。

3.結(jié)果判讀：

在實(shí)驗(yàn)有效的情況下，可根據(jù)下表進(jìn)行判讀：

u  97%以上大腸埃希氏菌為 uidA 陽(yáng)性，可參考陰性對(duì)照中該基因檢測(cè)結(jié)果判斷擴(kuò)增效果；

u  當(dāng)結(jié)果判定為EPEC 陽(yáng)性時(shí)，若 bfpB 靶標(biāo)為陽(yáng)性則說(shuō)明樣品含有典型EPEC；若 bfpB 靶標(biāo)為陰性則說(shuō)明樣品為非典型EPEC；

當(dāng)結(jié)果判定為STEC/EHEC 陽(yáng)性時(shí)，若 eae 靶標(biāo)為陽(yáng)性則說(shuō)明樣品含有典型EHEC；若 eae 靶標(biāo)為陰性則說(shuō)明樣品為非典型EHEC。