在藥物篩選中，如何高效便捷地評(píng)價(jià)藥物分子的細(xì)胞毒性呢？做細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的你，還在苦于計(jì)算細(xì)胞活力嗎？T仔這里有妙招奧
 

（一）染料排除法 

染料排除法的原理是活細(xì)胞能夠?qū)⒁恍┤玖吓懦谕舛兰?xì)胞無(wú)法做到，這是因?yàn)榛罴?xì)胞具有完整的細(xì)胞膜，對(duì)于通過(guò)膜通道的小分子具有高度的選擇性。

臺(tái)盼藍(lán)（Diphenyl Blue）是一種帶負(fù)電荷的約 960 Da 的重氮染料，它只能透過(guò)損壞的細(xì)胞膜，被死細(xì)胞吸收。這種染料可以在體外使用，如細(xì)胞培養(yǎng)；也可以在體內(nèi)使用，如觀察活體中的癌細(xì)胞群；它還可用于比較不同組別在特定條件下的活細(xì)胞數(shù)量或增殖率。臺(tái)盼藍(lán)在實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞計(jì)數(shù)中應(yīng)用廣泛，死細(xì)胞染色后在顯微鏡下會(huì)變藍(lán)，活細(xì)胞不染色，且外觀清晰。

盡管這種方法有許多優(yōu)點(diǎn)，包括經(jīng)濟(jì)、易于應(yīng)用，但它無(wú)法區(qū)分細(xì)胞凋亡或壞死，且靈敏度非常有限。
 

（二）基于細(xì)胞代謝的增殖分析實(shí)驗(yàn)

1.MTT 法

MTT 法基于 MTT 在線粒體 NAD(P)H 依賴型氧化還原酶催化下轉(zhuǎn)化成不溶性甲瓚，生成的甲瓚可以反映線粒體的活性，并可由此來(lái)確定活細(xì)胞的數(shù)量。增殖細(xì)胞具有更高的 MTT 轉(zhuǎn)化率，而緩慢生長(zhǎng)細(xì)胞的低代謝率導(dǎo)致了較低的 MTT 轉(zhuǎn)化率。應(yīng)用 MTT之后，用 DMSO 或者洗滌劑十二烷基硫酸鈉去溶解甲瓚晶體，甲瓚的濃度便可以利用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，波長(zhǎng)范圍為 540 到 720 nm。

MTT 法常用于分析藥物在不同條件或者濃度的細(xì)胞毒性作用，也可用于比較藥物組和對(duì)照組細(xì)胞活力從而測(cè)定藥物的 IC50 值，有助于確定藥物的體外作用以及預(yù)測(cè)臨床應(yīng)用。另一方面，由于檢測(cè)期間會(huì)殺死所有細(xì)胞，因此該方法可能會(huì)對(duì)后續(xù)的研究帶來(lái)不便。此外，它無(wú)法區(qū)分細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制作用，在細(xì)胞數(shù)目較少時(shí)結(jié)果可信度不高。

MTT 法原理【線粒體 NADH 通過(guò)脫氫酶轉(zhuǎn)化為 NAD+，該反應(yīng)導(dǎo)致活細(xì)胞中的黃色四氮唑鹽（MTT、XTT、MTS 和 WST）還原為紫色的甲瓚晶體?！?/span>

水溶性四氮唑鹽即 WST 已被開(kāi)發(fā)為新一代的細(xì)胞活性測(cè)定化合物，它同樣可在活細(xì)胞線粒體中的NADH酶作用下轉(zhuǎn)化為甲瓚晶體。此外，在 PMS 存在的情況下，WST-1 和 WST-8 比 XTT 及 MTS 結(jié)果穩(wěn)定性更好、檢測(cè)靈敏度更高。此外，WST 法無(wú)需額外的晶體溶解步驟，其試劑具有即開(kāi)即用的特點(diǎn)，能夠幫助研究者更快地完成實(shí)驗(yàn)。

LDH 釋放實(shí)驗(yàn)

【損傷或死亡細(xì)胞釋放的 LDH 催化乳酸氧化為丙酮酸，NAD+ 還原為 NADH 分子。產(chǎn)生的 NADH 被黃遞酶用于將  INT（四氮唑鹽）轉(zhuǎn)化為紅色甲瓚晶體，并進(jìn)行比色測(cè)量?！?/span>

LDH釋放實(shí)驗(yàn)

（熒光素酶利用細(xì)胞 ATP 催化外源性熒光素轉(zhuǎn)化為氧化熒光素，氧化熒光素產(chǎn)生的熒光被光度計(jì)捕捉并測(cè)量。）

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參考文獻(xiàn)：

Adan A, Kiraz Y, Baran Y. Cell Proliferation and Cytotoxicity Assays. Curr Pharm Biotechnol. 2016;17(14):1213-1221.doi:10.2174/1389201017666160808160513