RT-PCR,逆轉(zhuǎn)錄PCR或稱反轉(zhuǎn)錄PCR(Reverse Transcription PCR),是聚合酶鏈式反應的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中,RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下被逆轉(zhuǎn)錄成為互補DNA(complementary DNA,cDNA),再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。
基本原理:
用逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成與其互補的DNA(cDNA)的過程。因為mRNA末端存在Poly A,所以用Oligo dT作為通用引物與其互補。商品化的反轉(zhuǎn)錄試劑盒里通常除了Oligo dT之外,還可以用隨機引物,但一般用Oligo dT引物就可以了。
重要參數(shù):
不同mRNA拷貝成cDNA的效率不同;因此,適合于一種mRNA拷貝的條件可能對另一種mRNA不適合。一般來說,從事不均一mRMA群體時,所使用的條件是導致cDNA合成的終產(chǎn)量達到最大,下述參數(shù)十分重要。
1、逆轉(zhuǎn)錄酶: 有兩種不同的逆轉(zhuǎn)錄酶可以催化以mRNA為模板,oligo(dT)作為引物,合成與mRNA互補的cDNA鏈。一種來自純化的 AMV,由兩條肽鏈組成,具有聚合酶活性和很強的RNA酶H活性,它最適溫度是42℃,最適pH8.3。在高反應溫度時可消除mRNA的二級結構對逆轉(zhuǎn)錄的阻礙,然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA產(chǎn)生也限制其長度。另外,禽源逆轉(zhuǎn)錄酶制劑可被能切割DNA的核酸內(nèi)切酶污染。
另一種是Mo-MLV,是單肽鏈的,有RNA聚合酶活性和相對較弱的RNA酶H活性,最適溫度37℃,最適pH7.6,較弱的RNA酶H活性對獲得2-3kb的mRNA的全長cDNA有很大好處。在第一鏈反應前可用氫氧化甲基汞處理,破壞mRNA的二級結構,這一步對于最適反應溫度較低(37)℃的鼠源逆轉(zhuǎn)錄酶催化的反應可能更為重要。臨合成cDNA第一鏈之前加入過量的巰基試劑,可以使氫氧化甲基汞從RNA上解離。
2、單價陽離子: 離子條件基本上影響各種模板的轉(zhuǎn)錄效率。用鉀比用鈉離子可獲得較長的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。對于cDNA長度的最適鉀離子濃度為140-150mM。
3、二價陽離子: 對于反轉(zhuǎn)錄酶活性來說,二價陽離子是必需的。低于4mM Mg2 未能觀察到活性;產(chǎn)生全長轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的最適濃度是6-10mM。
4、脫氧核苷三磷酸: 使用四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)中每一種的高濃度對于有效合成cDNA是特別重要的。如果其中只有一種的濃度下降到10-50微摩爾以下,全長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)量將明顯下降。常用的dNTP的濃度為200-250微摩爾。
注意事項:
1、RNA 提取一定要迅速,樣本要新鮮,組織盡量在液氮中研磨;
2、RNA 提取完馬上進行逆轉(zhuǎn)錄不要拖延,新提的RNA很容易降解;
3、逆轉(zhuǎn)錄反應過程,需建立無RNAase環(huán)境,以避免模板RNA降解。
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