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          超濾離心管使用方法和注意事項

          來源:杭州柏納科技發(fā)展有限公司   2021年08月27日 10:11  

          超濾離心管使用方法和注意事項

          離心管就是一個簡單的可以承受高轉(zhuǎn)速壓力的管子,比如離一些樣品,分離出上清沉淀。 蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管,目前常用的就是Millipore的。目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標(biāo)體積而定??芍貜?fù)使用,使用一次就扔掉太浪費(fèi)。

          離心超濾管會有一個類似于內(nèi)管和外管的兩個部分,內(nèi)管中是帶有一定分子量的膜,當(dāng)高速離心時,分子量比它小的就漏到下面的管子(即外管)中了,分子量比它大的就截留在上面(即內(nèi)管中),就是超濾的原理。超濾離心管的選擇主要看你要截留那部分物質(zhì),就選擇比最小分子量小的,如果你要截留26KD的,你要的超濾管就要比26小。但兩者也要有一定的差距,比如,選擇20-25KD之間的就不合適,因?yàn)?6的也可能會出去(這是由制造工藝決定的)。所以選擇20KD以下的超濾管比較合適。

          以下是給大家總結(jié)的超濾離心管使用方法和注意事項。

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          選擇合適的超濾管,主要考慮MWCO和濃縮體積,最常見的是10kD。到底選擇多大截留分子量比較合適呢?10kDa、 5kDa、還是30kDa?通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3,比如目的蛋白分子量為35kDa,就可以選擇10kDa截留分子量的超濾 管。若目的蛋白分子量為10kD左右,則可以用截留分子量3kD的超濾管。認(rèn)真閱讀使用說明書,注意超濾膜對各種化學(xué)物質(zhì)的耐受程度有所不同,表格中有。

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          新買來的超濾是干燥的,使用前加入MilliQ水,水量*過膜,冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘。然后將水倒出,即可加入蛋白液,加入的多少,以不超過管頂?shù)陌拙€為準(zhǔn)。操作要輕,加入蛋白液前,超濾管需要插在冰上預(yù)冷。

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          平衡。質(zhì)量和重心二者都要達(dá)到平衡。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快,否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾(離心機(jī)預(yù)冷至4度)。不同離心機(jī)的轉(zhuǎn)速 rpm換算成g之后,有所不同。具體可參閱附件里的說明書。離心機(jī)的加速度調(diào)至低檔,減小對膜的壓力。注意,一定要等離心機(jī)達(dá)到目的轉(zhuǎn)速之后,方可離開離心機(jī),否則離心機(jī)出問題時,無法第一時間處理,后果不可預(yù)測!膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說明書調(diào)整(角轉(zhuǎn)離心機(jī)的情況是膜與軸垂直)。在實(shí)際使用中,一般轉(zhuǎn)速開的比說明書里的要低,這樣可以延長離心管的使用壽命。

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          當(dāng)濃縮到剩下1ml時,【取50ul國產(chǎn)Bradford溶液,加入10ul流穿,看有沒變藍(lán)色,以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了,將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管,用5mg/ml的BSA離心10min,再取流穿,跑蛋白膠或Bradford粗測】,繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮(在冰上操作,防止蛋白受熱),直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀,導(dǎo)致堵管。若發(fā)生沉淀,要確定沉淀的具體原因,是蛋白濃度過高還是Buffer不合適;前者可用多根超濾管同時超濾,降低濃度的辦法解決,后者的方法是換不同的Buffer,直到蛋白不發(fā)生沉淀為 止。

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          前面幾步用以濃縮蛋白,如果要換Buffer,在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候,輕輕加入新的Buffer(經(jīng)0.22um超濾膜超濾),再 濃縮至1ml左右,連續(xù)三次,最后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定,一般不多于500ul,也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況。按照每次至少10倍 左右的體積濃縮算,三次達(dá)到1000倍以上,基本上可以達(dá)到換buffer的目的。

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          取出最終蛋白濃縮液的操作在冰上操作,用黃槍頭(200ul)取,輕輕順著邊緣插入槍頭,輕輕吹打、混勻蛋白液,注意不要碰到超濾膜,然后吸取濃縮液,每次吸接近200ul,直到吸完。管底剩下的最后一點(diǎn)濃縮液不必吸取,否則難度太大,有可能損壞超濾膜。最后加入MilliQ水到超濾管中,沒過 超濾膜,防止膜失水變干。

          以下是處理超濾管,重復(fù)利用超濾管的步驟。

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          倒出超濾管里的水,用milliQ水輕輕潤洗幾次,【若管底有可見的蛋白沉淀,可以先加入水,然后用槍頭吹打,注意不要碰到膜,吹打至沉淀懸起,然后倒掉,不可用自來水猛沖】然后加入0.2M的NaOH溶液,室溫放置20min,期間平衡超濾管。再離心10min。倒出殘留的NaOH溶液,將 管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個小時,再換新的水,放置幾個小時,不斷稀釋NaOH濃度。50ml管和蓋子用自來水洗,內(nèi)壁再用 MilliQ水洗干凈。

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          取出浸沒的管芯,加至接近滿的MilliQ水,50ml管也加滿MilliQ水,將管芯慢慢放入50ml離心管,排出部分水,然后蓋上蓋子,放4度保存,直到下次使用。一般來說,按照上述步驟和注意事項,每根管用三四年不會壞。


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