概述

基于 T 細(xì)胞的療法正在迅速發(fā)展成為許多癌癥的有效一線治療選擇。近年來(lái)， FDA 已經(jīng)批準(zhǔn)了幾種針對(duì)免疫檢查點(diǎn)的治療性抗體和小分子用于臨床，以補(bǔ)充和提高T 細(xì)胞的靶向性和有效性。這些免疫檢查點(diǎn)抑制劑的臨床前篩選需要強(qiáng)大的體外腫瘤模型來(lái)評(píng)估 T 細(xì)胞殺傷效率。但是，傳統(tǒng)的 2D 腫瘤模型通常缺乏生物學(xué)相關(guān)性和復(fù)雜性來(lái)預(yù)測(cè)體內(nèi)或臨床結(jié)果。 3D 生物打印平臺(tái)以及許多其他 3D 培養(yǎng)方法，提供了在生理上更相關(guān)的組織模型中自動(dòng)篩選各種分子和藥物的潛力。在此，在此概念驗(yàn)證研究中，我們描述了小鼠肺癌的同系生物打印腫瘤模型，以在細(xì)胞細(xì)胞毒性測(cè)定中評(píng)估免疫檢查點(diǎn)抑制劑（PD-1）。在生物印記的腫瘤中觀察到 T 細(xì)胞濃度依賴(lài)性殺傷， 并且添加免疫檢查點(diǎn)抗體進(jìn)一步增強(qiáng)了 T 細(xì)胞殺傷效力。有人建議，生物打印的 T 細(xì)胞細(xì)胞毒性測(cè)定法可能使研究人員能夠在更有效的轉(zhuǎn)化模型中篩選檢查點(diǎn)抑制劑。

引言

T 淋巴細(xì)胞（T 細(xì)胞）在實(shí)現(xiàn)對(duì)傳染病和癌癥的長(zhǎng)期免疫中起著至關(guān)重要的作用。 T 細(xì)胞可以在感染或癌細(xì)胞表面上的主要組織相容性復(fù)合物（MHC）分子的背景下識(shí)別特定抗原。這種特異性識(shí)別導(dǎo)致 T 細(xì)胞分泌有毒顆粒，從而特異性殺死靶細(xì)胞。傳統(tǒng)上，已經(jīng)使用在二維（2D）單層中生長(zhǎng)的靶細(xì)胞進(jìn)行了 T 細(xì)胞殺傷（細(xì)胞毒性）測(cè)定（Golstein，2018）。這些 2D 分析可通過(guò)成像或其他方式快速輕松地進(jìn)行終點(diǎn)分析。但是，在人體內(nèi)部，T 細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞殺傷發(fā)生在三維（3D）環(huán)境中，這歸因于 T 細(xì)胞遷移或滲入 3D 組織核心的其他障礙。因此，3D T 細(xì)胞細(xì)胞毒性測(cè)定法在生理上更相關(guān)，并被認(rèn)為可以更好地預(yù)測(cè)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。在免疫刺激劑的臨床試驗(yàn)中，使用三維腫瘤模型進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)越來(lái)越受到關(guān)注。

檢查點(diǎn)阻斷療法的Z XIN 發(fā)展*改變了癌癥治療領(lǐng)域，通過(guò)抑制免疫檢查點(diǎn)來(lái)增強(qiáng) T 細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷（Topalian，2016）。幾種檢查點(diǎn)抑制劑，例如抗PD1 和抗 PD-L1 抗體，已被批準(zhǔn)用于臨床（Sharon，2014 年）。然而，開(kāi)發(fā)高通量 T 細(xì)胞毒性測(cè)定法以快速和低成本地篩選此類(lèi)抑制劑的需求仍然沒(méi)有得到滿足。

已經(jīng)研究了幾種 3D 腫瘤模型，包括球狀體、懸滴和微流控芯片模型，用于 T 細(xì)胞細(xì)胞毒性測(cè)定。 例如，膠原蛋白-纖維蛋白凝膠用于在 3D 環(huán)境中生長(zhǎng)癌細(xì)胞，以確定殺死所有癌細(xì)胞所需的 T 細(xì)胞的絕DUI濃度（Budhu，2010）。近，微流體球體培養(yǎng)用于免疫檢查點(diǎn)封鎖的體外分析（Jenkins，2018）。 盡管這些模型在模仿體內(nèi)環(huán)境的某些方面顯示出希望，但它們通常通量低或無(wú)法考慮細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）在腫瘤生物學(xué)中的關(guān)鍵作用。

生物打印是一項(xiàng)新興技術(shù)，使研究人員能夠自動(dòng)化制造腫瘤構(gòu)建體以篩選抗癌藥或免疫刺激劑。該技術(shù)沉積了一種充滿細(xì)胞的 ECM 材料（通常稱(chēng)為生物墨水），與腫瘤細(xì)胞混合，隨后進(jìn)行化學(xué)或熱固化，從而為打印結(jié)構(gòu)提供機(jī)械強(qiáng)度。在這里，我們探索了3D T 細(xì)胞細(xì)胞毒性測(cè)定法的生物打印技術(shù)的潛力，以幫助評(píng)估免疫檢查點(diǎn)抑制劑。

材料和方法

細(xì)胞準(zhǔn)備

為該項(xiàng)目選擇了小鼠肺癌細(xì)胞系（LLC-1）和同型 OT-1T 細(xì)胞。兩種細(xì)胞類(lèi)型均在C57BL/6 背景中。 Lewis 肺癌細(xì)胞（LLC-1）從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）獲得，并根據(jù)建議的方案進(jìn)行培養(yǎng)，每 3 至 4 天傳代一次。 為了促進(jìn)活腫瘤細(xì)胞的成像，將編碼紅色熒光蛋白（RFP）的質(zhì)粒引入 LLC-1 細(xì)胞，以生成穩(wěn)定的 LLC-RFP 細(xì)胞。LLC-RFP 細(xì)胞（此后稱(chēng)為“LLC-1”）用于其余實(shí)驗(yàn)。按照先前發(fā)布的方案（Nath，2016 年），使用 0.75µg / mL SIINFEKL（Ova）肽（New England Peptide）培養(yǎng) OT-1 脾細(xì)胞并將其灌注 5 天。 在第 5 天的共培養(yǎng)研究中，未經(jīng)進(jìn)一步純化就使用了引發(fā)的細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞（CTL）。

生物墨水的制備和生物打印

中和膠原蛋白 I（CELLINK），并與每毫升膠原蛋白中的 106LLC-1 細(xì)胞混合。將所有組件（包括注射器，針頭和針尖）置于冰上，直至準(zhǔn)備使用。將溫度控制的打印頭（TCPH）設(shè)置為 8°C，而將打印床設(shè)置為 10°C。使用 BIO X（軟件版本 1.8）上的液滴功能在 96 孔板（n= 3）中對(duì)三維 LLC-1 腫瘤進(jìn)行生物打印（見(jiàn)圖 1）。印刷后，將 96 孔板轉(zhuǎn)移到 37°C 的恒溫培養(yǎng)箱中 20 分鐘，以使膠原蛋白聚合。接下來(lái)，將 200 µL DMEM 培養(yǎng)基添加到每個(gè)孔中。 媒體每 3 天刷新一次。 腫瘤生長(zhǎng) 5 天，然后與 T 細(xì)胞共培養(yǎng)。

圖 1. 腫瘤的三維（3D）生物打印。 使用 BIO X 的液滴打印功能，用膠原蛋白對(duì) Lewis 肺癌細(xì)胞（LLC-1）進(jìn)行膠原蛋白印刷。將膠原蛋白液滴（腫瘤）熱固化并在 DMEM 培養(yǎng)基中保持 5 天，然后再與 T 細(xì)胞共培養(yǎng)。

在第 4 天，將打印的腫瘤與 1 µg/ mL 的 SIINFEKL 肽孵育 24 小時(shí)，以使腫瘤細(xì)胞表達(dá)相關(guān)抗原。 在第 5 天， 洗滌打印的腫瘤， 并以不同的效應(yīng)子與靶標(biāo)（ E∶T） 比（0∶5）與 T 細(xì)胞共培養(yǎng) 48 小時(shí)。對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照，將腫瘤與依托泊苷或 TNFα孵育以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡引起的細(xì)胞死亡。 陰性對(duì)照孔未接受任何 T 細(xì)胞或凋亡誘導(dǎo)劑。對(duì)于抗原特異性，少數(shù)（n = 8）孔中的腫瘤未用 SIINFEKL 治療，但接受了引發(fā)的 T 細(xì)胞。

為了進(jìn)行免疫檢查點(diǎn)分析， 將引發(fā)的 T 細(xì)胞用 1μg/mL 的抗 PD-1 抗體（ 克隆RMP1-14，InVivoMab）預(yù)處理 1 小時(shí)，然后將其加入與腫瘤的共培養(yǎng)物中（n = 8）。保留 IgG 同種型對(duì)照用于比較。

影像和統(tǒng)計(jì)

如先前所述（Steff，2001；Strebel，2001），RFP 熒光的損失被用作腫瘤細(xì)胞死亡的讀數(shù)。 使用 EVOS Auto 2 熒光顯微鏡進(jìn)行成像。 使用 ImageJ 軟件（NIH）測(cè)量熒光強(qiáng)度，并使用 Graphpad Prism 8 進(jìn)行圖形翻譯和制備。通過(guò)使用學(xué)生的 t 檢驗(yàn)在 Prism 中對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。

結(jié)果與討論

腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和球狀體形成

BIO X 上的液滴功能能夠自動(dòng)將穩(wěn)定的膠原蛋白腫瘤液滴分配到 96 孔板中。 液滴形狀和孔位置的均勻性有助于整個(gè)顯微鏡和分析工作流程。 對(duì)打印的腫瘤進(jìn)行 RFP 熒光成像，并用 Calcein AM 染色以確定細(xì)胞活力。 圖 2 中顯示的結(jié)果表明，LLC-1 細(xì)胞在第5 天在打印的腫瘤中是可行的。此外，這些細(xì)胞被限制在膠原蛋白內(nèi)，而不是逃逸其結(jié)構(gòu)以在 2D 表面上生長(zhǎng)。

圖 2. 腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和生存力。 對(duì)打印的腫瘤進(jìn)行 RFP 熒光成像，并用鈣黃綠素 AM 染色以確定 T 細(xì)胞篩選前第 5 天的細(xì)胞活力。

3D 中的 T 細(xì)胞細(xì)胞毒性測(cè)定

T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性被定量和定性驗(yàn)證。 當(dāng)將腫瘤與 T 細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，觀察到腫瘤細(xì)胞活力的 T 細(xì)胞濃度依賴(lài)性降低（見(jiàn)圖 3A）。 在 5：1（E：T）的比率（代表 106 CTL/孔）下，與無(wú) CTL 對(duì)照相比，觀察到了腫瘤生存力的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著降低（p=0.0003）（?30％）。 在存在或不存在 T 細(xì)胞的情況下，打印腫瘤的代表性圖像顯示在圖 3B中，當(dāng)在共培養(yǎng)物中存在 T 細(xì)胞時(shí)，RFP 熒光顯示出質(zhì)的下降。T 細(xì)胞能夠附著在膠原屏障上并在 3D ECM 環(huán)境中與癌細(xì)胞相互作用。

圖 3. 在第 5 天使用 3D 生物打印的腫瘤模型進(jìn)行 T 細(xì)胞細(xì)胞毒性測(cè)定。（A）觀察到 T 細(xì)胞濃度依賴(lài)性地降低了腫瘤細(xì)胞的活力，這是通過(guò) RFP 熒光的喪失來(lái)確定的。 CTL 的數(shù)量代表每孔的總 CTL。 （B）顯示了在存在或不存在 T 細(xì)胞的情況下打印的腫瘤的代表性圖像。 使用相同的采集參數(shù)拍攝圖像。

免疫檢查點(diǎn)測(cè)定

為了擴(kuò)大 T 細(xì)胞殺傷的效用或限制，將腫瘤與經(jīng)抗 PD1 抗體預(yù)處理的初免 T 細(xì)胞以 5：1 的 E：T 比例共培養(yǎng)。如圖 4 所示，與同種型對(duì)照相比，使用抗 PD1 抗體阻斷 PD-1 / PD-L1 軸顯示出 T 細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷的增加（p＝0.0039）。 因此，由于 PD-1 檢查點(diǎn)的阻滯，引發(fā)的 T 細(xì)胞能夠更有效地附著在膠原蛋白屏障上， 更有效地浸潤(rùn)和殺死腫瘤細(xì)胞。

圖 4. 免疫檢查 （A）顯示了免疫檢查點(diǎn)阻斷測(cè)定的示意圖。 單克隆抗 PD1 抗體阻斷了 PD1 與 PD-L1 之間的相互作用，從而增強(qiáng)了 T 細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力。（B）在 IgG 同種型對(duì)照或抗 PD1 抗體存在下，將 3D 生物打印的腫瘤細(xì)胞與初免化的 T 細(xì)胞以 5：1 的 E：T 比例共培養(yǎng)。 PD1 阻斷顯示出對(duì)靶細(xì)胞的增強(qiáng)殺傷作用。