人原代牙周膜干細(xì)胞的背景與應(yīng)用！

一、背景

人原代牙周膜干細(xì)胞來源于人的正常牙組織，牙周病是口腔疾病中的常見病和多發(fā)病，常導(dǎo)致牙周支持組織破壞或缺損。目前，牙周支持組織重建主要依賴機(jī)械、藥物或引導(dǎo)組織再生技術(shù)，隨著分子生物學(xué)、組織工程學(xué)和干細(xì)胞技術(shù)的飛速發(fā)展，牙周組織再生工程技術(shù)成為牙周病治療研究的熱點(diǎn)，牙周膜干細(xì)胞(Periodontal ligament stem cell，PDLSC）是牙周組織再生工程的關(guān)鍵種子細(xì)胞之一。因此，關(guān)于牙周膜干細(xì)胞的研究逐漸成為熱點(diǎn)。

干細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞,它包括胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞由于倫理學(xué)問題在臨床上的應(yīng)用受到限制.成體干細(xì)胞通常以極少量的數(shù)量存在于局限的區(qū)域。從不同組織中分離成體干細(xì)胞目前尚無統(tǒng)一、理想的方法,主要是根據(jù)干細(xì)胞具有克隆形成能力的普遍特點(diǎn)和不同干細(xì)胞所*的生物、物理學(xué)特性進(jìn)行分離和鑒定的。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨髓基質(zhì)中的干細(xì)胞,是目前研究充分、應(yīng)用泛的干細(xì)胞。已有研究表明,牙周膜中存在著干細(xì)胞,表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記物Stro-1,并具有多向分化潛能,稱為牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligment stem cells,PDLSCs),可作為牙周再生的種子細(xì)胞。干細(xì)胞在臨床治療中的應(yīng)用越來越廣泛,研究表明,其增殖與分化是影響治療效果的關(guān)鍵因素。

干細(xì)胞的增殖和分化受多種內(nèi)在機(jī)制和微環(huán)境因素的影響。微環(huán)境是影響干細(xì)胞移植治療效果、影響組織再生的重要因素。在組織再生的過程中經(jīng)常會遇到因遭到嚴(yán)重破壞而發(fā)生炎性反應(yīng)的過程。干細(xì)胞處于炎性微環(huán)境中,其增殖和分化的調(diào)控很可能受到炎性因子的影響。

二、應(yīng)用

人原代牙周膜干細(xì)胞可用于TNF-α對牙周膜干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化及骨創(chuàng)傷修復(fù)影響的研究：

炎性微環(huán)境中的炎性分子包括內(nèi)源性的炎性介質(zhì)(TNF-α,IL-1β,PGE2等)以及外源性分子(細(xì)菌脂多糖lipopolysaccharide,LPS,磨損顆粒particulate debris,機(jī)械張力或剪切力等)。其中TNF-α是目前*的重要的一個內(nèi)源性誘生型促炎細(xì)胞因子,也是內(nèi)毒素引起的感染性疾病直接關(guān)鍵的炎癥介質(zhì)。TNF-α通過激活靶細(xì)胞內(nèi)MAPKS與NF-κB通路使細(xì)胞發(fā)生增殖、分化、炎癥等應(yīng)激反應(yīng)。

NF-κB是一種廣泛存在于體內(nèi)細(xì)胞的核轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子、粘附分子、免疫受體基因的表達(dá),影響機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞分化、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、腫瘤生長等多種生物學(xué)功能?，F(xiàn)有研究結(jié)果顯示炎性因子能夠影響成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)的分泌以及成骨細(xì)胞的凋亡。然而,這些研究大都以鼠成骨細(xì)胞系為研究對象,并沒有說明干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程中炎性信號通路的作用。因此,在組織再生過程中,慢性、長期、高濃度的炎性微環(huán)境對于成體干細(xì)胞增殖和分化的影響亟需深入的研究。

本研究采用免疫磁珠法分離PDLSCs和BMSCs,以不同濃度TNF-α刺激PDLSCs和BMSCs,探討TNF-α對PDLSCs和BMSCs增殖和成骨分化的影響；并對這種影響的信號通路進(jìn)行了初步探討；同時進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn),觀察在BMSCs中阻斷NF-κB通路對于骨創(chuàng)傷愈合的影響,以期更好地了解炎癥刺激條件下成體干細(xì)胞的生物學(xué)特性以及基于成體干細(xì)胞的創(chuàng)傷修復(fù)過程,為臨床研發(fā)新的更有效的牙周治療方法開辟一條新思路。

TNF-α對PDLSCs和BMSCs增殖和成骨分化影響的研究組織塊法分離培養(yǎng)人原代牙周膜細(xì)胞,復(fù)蘇-80℃凍存的ST2細(xì)胞,傳代培養(yǎng),細(xì)胞生長狀態(tài)良好后用生物素標(biāo)記的Stro-1抗體,免疫磁珠正選法分離PDLSCs和ST2細(xì)胞中BMSCs,免疫細(xì)胞化學(xué)染色和礦化誘導(dǎo)初步鑒定其干細(xì)胞特性；MTT法檢測不同濃度TNF-α對PDLSCs和BMSCs增殖的影響；PNPP法檢測礦化誘導(dǎo)條件下不同濃度TNF-α對PDLSCs和BMSCs堿性磷酸酶活力的影響；實(shí)時定量PCR檢測不同濃度TNF-α對PDLSCs和BMSCs成骨分化基因OSX,RUNX2,ALP,OC mRNA的影響；礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色法檢測不同濃度TNF-α對PDLSCs和BMSCs礦化的影響。

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