GFP是什么?GFP 綠熒光蛋白(Green Fluorescent Portein,GFP)
綠色熒光蛋白是一類存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔腸動(dòng)物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白,當(dāng)受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時(shí),發(fā)射綠色熒光。其特點(diǎn)在于:它產(chǎn)生熒光無需底物或輔因子,發(fā)色團(tuán)是其蛋白質(zhì)一級(jí)序列固有的來源于水母的氨基酸殘基組成。水母的綠色熒光蛋白很穩(wěn)定,無種屬限制,已在多種動(dòng)植物細(xì)胞中表達(dá)成功并產(chǎn)生熒光。GFP 的熒光受外界的影響較小,另外GFP 的檢測(cè)十分方便,而對(duì)細(xì)胞的傷害小。
綠色熒光蛋白GFP的發(fā)光特性:
GFP吸收的光譜峰值為395nm(紫外),并有一個(gè)峰值為470nm的副吸收峰(藍(lán)光);發(fā)射光譜峰值為509nm(綠光),并帶有峰值為540nm的側(cè)峰(Shouder)。雖然450~490nm只是GFP的副吸收峰,但由于該激發(fā)光對(duì)細(xì)胞的傷害小,因此通常多使用該波段光源(多為488nm)。此外,GFP的光譜特性與熒光素異硫氰酸鹽(FITC)很相似,兩者通常共有一套濾光片。GFP熒光極其穩(wěn)定,在激發(fā)光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比熒光素強(qiáng),特別是在450~490nm藍(lán)光波長(zhǎng)下穩(wěn)定。類似的,GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高,抗光漂白能力強(qiáng),因此適用于定量測(cè)定與分析。由于GFP熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物,因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報(bào)告蛋白,其作用是任何其它酶類報(bào)告蛋白*的。但因?yàn)镚FP不是酶,熒光信號(hào)沒有酶學(xué)放大效果,因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報(bào)告蛋白,比如螢火蟲熒光素酶等。
熒光蛋白激發(fā)光源的主要產(chǎn)品應(yīng)用:
檢測(cè)轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白(GFP)基因、紅色熒光蛋白(DsRed)基因植物:水稻、小麥、玉米、大豆、棉花、擬南芥
檢測(cè)轉(zhuǎn)GFP、DsRed基因動(dòng)物:小鼠、兔子、猴子等;
檢測(cè)轉(zhuǎn)GFP、DsRed基因微生物:細(xì)菌、真菌、酵母等;
檢測(cè)GFP、DsRed基因組織特異性表達(dá);
綠色熒光蛋白GFP的常規(guī)觀察方法有三種:
1.熒光顯微鏡
熒光顯微鏡(Fluorescence microscope) : 熒光顯微鏡是以紫外線為光源, 用以照射被檢物體,使之發(fā)出熒光,然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。 細(xì)胞中有些物質(zhì),如葉綠素等,受紫外線照射后可發(fā)熒光;另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光,但如果用熒光染料或熒光抗體染色后,經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光,熒光顯微鏡就是對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。目前在常用的方法就是采用熒光顯微鏡觀察,熒光顯微鏡在實(shí)驗(yàn)室普及,但不足的是必須采集葉片或動(dòng)物切片進(jìn)行觀察,對(duì)培養(yǎng)的標(biāo)本進(jìn)行破壞,無法進(jìn)行活體觀察。
2.紫外光源
采用紫外光源(又叫紫外線燈、黑光燈)觀察也非常方便,但如果觀察植物,植物葉片的葉綠色在紫外線燈下也會(huì)發(fā)出熒光,對(duì)gfp發(fā)出的熒光也會(huì)產(chǎn)生干擾,另外,標(biāo)本長(zhǎng)時(shí)間在紫外光源照射下對(duì)GFP標(biāo)本組織也會(huì)造成破壞。
3.便攜式GFP激發(fā)光源
采用便攜式GFP激發(fā)光源(又叫熒光蛋白觀測(cè)鏡)是便捷、方便的觀察方法,因GFP在470nm有一個(gè)很高的吸收峰,采用 470nm激發(fā)光源能夠激發(fā)GFP發(fā)出明亮的綠色熒光,在觀察gfp熒光時(shí),因?yàn)榧ぐl(fā)光為強(qiáng)烈的藍(lán)色光線,佩戴專業(yè)的觀察眼鏡才能觀察到清晰的熒光信號(hào)。推薦使用美國(guó)LUYOR-3260便攜式激發(fā)光源。因此,使用便攜式GFP激發(fā)光源為方便有效的觀察辦法。
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1.大功率輸出,無需暗室,也可輕松激發(fā)熒光。
2.檢測(cè)效率高,黑暗中檢測(cè)一目了然
3.LED壽命50000h,且系統(tǒng)穩(wěn)定,可長(zhǎng)時(shí)間使用
4.直接檢測(cè),而無需用底物顯色,所以安全,對(duì)被檢測(cè)對(duì)象無傷害
LUYOR-3415熒光蛋白激發(fā)光源的物理技術(shù)參數(shù):
波長(zhǎng):可任意選擇2種波長(zhǎng):365nm,400nm, 450nm, 485nm,520nm
質(zhì)量:凈重0.9kg,毛重:4kg,尺寸:180x200mm(長(zhǎng)x高),頭部直徑120mm。
功率:?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)15w,總功率27w。
輸入電壓:交流100-260v,頻率50/60Hz。
包裝箱尺寸:400x300x150mm(長(zhǎng)x寬x高)
距燈150mm處照射直徑為180mm
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