① 引物長(zhǎng)度

一般引物長(zhǎng)度為18~30堿基。總的說來，決定引物退火溫度（Tm值）重要的因素就是引物的長(zhǎng)度。有以下公式可以用于粗略計(jì)算引物的退火溫度。

在引物長(zhǎng)度小于20bp時(shí)：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

在引物長(zhǎng)度大于20bp時(shí)：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外有許多軟件也可以對(duì)退火溫度進(jìn)行計(jì)算，其計(jì)算原理會(huì)各有不同，因此有時(shí)計(jì)算出的數(shù)值可能會(huì)有少量差距。為了優(yōu)化PCR反應(yīng)，使用確保退火溫度不低于54℃的短的引物可獲得好的效率和特異性。

總的說來，每增加一個(gè)核苷酸引物特異性提高4倍，這樣，大多數(shù)應(yīng)用的短引物長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸。引物長(zhǎng)度的上限并不很重要，主要與反應(yīng)效率有關(guān)。由于熵的原因，引物越長(zhǎng)，它退火結(jié)合到靶DNA上形成供DNA聚合酶結(jié)合的穩(wěn)定雙鏈模板的速率越小。

② GC含量

一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%，一對(duì)引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴(yán)重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5’端加適量的A、T或G、C尾巴。

③ 退火溫度

退火溫度需要比解鏈溫度低5℃，如果引物堿基數(shù)較少，可以適當(dāng)提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當(dāng)減低退火溫度，是DNA雙鏈結(jié)合。一對(duì)引物的退火溫度相差4℃～6℃不會(huì)影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對(duì)引物的退火溫度是一樣的，可以在55℃～75℃間變化。 ④ 避免擴(kuò)增模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域

選擇擴(kuò)增片段時(shí)好避開模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè)估計(jì)目的片段的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。

⑤ 與靶DNA的錯(cuò)配

當(dāng)被擴(kuò)增的靶DNA序列較大的時(shí)候，一個(gè)引物就有可能與靶DNA的多個(gè)地方結(jié)合，造成結(jié)果中有多個(gè)條帶出現(xiàn)。這個(gè)時(shí)候有必要先使用BLAST軟件進(jìn)行檢測(cè)，