標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證鑒定步驟！

一、菌種活化：包括干粉標(biāo)準(zhǔn)菌株、標(biāo)準(zhǔn)貯備菌株及工作菌株；

⒈金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株：挑取部分干粉溶解于0.9%無菌氯化鈉溶液中，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，36℃±1℃培養(yǎng)18-24小時。并觀察菌落形態(tài)。

a.金黃色葡萄球菌：菌落凸起，圓形，不透明；

b.大腸埃希氏菌：菌落稍凸，圓形，濕潤，乳白色；

c.銅綠假單胞菌：菌落扁平，圓形，邊緣不整齊，光滑濕潤，可產(chǎn)生藍(lán)綠或黃綠色素；

d. 枯草芽孢桿菌: 表面粗糙不透明，鏡檢菌體有芽孢。

⒉白色念珠菌：挑取部分干粉溶解于0.9%無菌氯化鈉溶液中，劃線接種于改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基平板或PDA瓊脂平板上，30℃-35℃培養(yǎng)24-48小時。本菌細(xì)胞呈卵圓形，很象酵母菌，比葡萄球菌大5～6倍，革蘭氏染色陽性，但著色不均勻。

黑曲霉：挑取部分干粉溶解于0.9%無菌氯化鈉溶液中，劃線接種于改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23℃-28℃培養(yǎng)48-96小時。菌叢呈黑褐色，粗糙。

⒊生孢梭菌：挑取部分干粉溶解于0.9%無菌氯化鈉溶液中，接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30℃～35℃培養(yǎng) 18-24小時；或在厭氧條件下接種于哥倫比亞瓊脂上，30℃～35℃厭氧培養(yǎng) 18-24小時。

二、菌種鑒定：

⒈金黃色葡萄球菌：

革蘭氏染色試驗(yàn)：革蘭氏陽性菌(紫色)，葡萄狀排列，球菌。

兔血漿試驗(yàn)：接種1個單菌落于1支兔血漿溶液中，30℃-35℃培養(yǎng)至6小時，每半小時觀察一次。凝固為陽性。金黃色葡萄球菌為陽性反應(yīng)。

⒉大腸埃希氏菌：

革蘭氏染色試驗(yàn)：革蘭氏陰性桿菌，紅色。

IMVC生化試驗(yàn)：

⒊銅綠假單胞菌：

革蘭氏染色試驗(yàn)：革蘭氏陰性桿菌，紅色。

氧化酶試驗(yàn)：將氧化酶試紙用蒸餾水浸濕，用細(xì)玻璃棒或一次性接種針挑取單個菌落，涂在試紙上。在60s內(nèi)變?yōu)樗{(lán)色或藍(lán)紫色為陽性，不變色為陰性。

綠膿菌素試驗(yàn)：取斜面培養(yǎng)物接種于 PDP 瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng) 24 小時，加三氯甲烷 3～5ml 至培養(yǎng)管中，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加入 1mol/L 鹽酸試液約 1ml，振搖后，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素試驗(yàn)陽性，否則為陰性。本菌為綠膿菌素試驗(yàn)陽性。

熒光試驗(yàn)：接種于金氏B培養(yǎng)基(或假單胞菌產(chǎn)熒光色素培養(yǎng)基)上，36℃±1℃培養(yǎng)18-24小時，在366nm紫色燈下有藍(lán)綠色熒光。

⒋枯草芽孢桿菌：

菌落形態(tài)：表面粗糙不透明，有皺摺。

鏡檢：用芽孢染色液染色，菌體有芽孢。

⒌白色念珠菌：

革蘭氏染色試驗(yàn)：呈卵圓形，很象酵母菌，比葡萄球菌大5～6倍，革蘭氏染色陽性，但著色不均勻。

念球菌顯色培養(yǎng)基：30-35℃培養(yǎng)24-48小時，呈綠色菌落。

產(chǎn)芽管試驗(yàn)：挑取1%吐溫80-玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿內(nèi)，置 35～37℃、1～3 小時，置顯微鏡下觀察，可見到由孢子長出短小芽管。

⒍黑曲霉：

23℃-28℃培養(yǎng)48-96小時。菌叢呈黑褐色，粗糙，有黑色孢子產(chǎn)生。

⒎生孢梭菌：

革蘭氏染色試驗(yàn)：革蘭陽性梭菌，有或無卵圓形或球形的芽孢。

哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基試驗(yàn)：接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，置厭氧條件下培養(yǎng) 48～72 小時，應(yīng)生長。

過氧化氫酶試驗(yàn)：滴加 3%過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產(chǎn)生，為過氧化氫酶試驗(yàn)陽性，否則為陰性。本菌為陰性反應(yīng)。

三、需購買試劑：

菌株                          培養(yǎng)基及試劑

金黃色葡萄球菌    HB8278革蘭氏染色液試劑盒、HB4117 兔血漿、HB0109-7營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基

大腸埃希氏菌     HBIG13  HBI大腸桿菌生化鑒定條、HB8280甲基紅試劑盒、HB8281 V-P試劑盒、HB8279 Kovacs氏靛基質(zhì)試劑盒

銅綠假單胞菌     HB5187綠膿菌素測定培養(yǎng)基(PDP）、HB2100氧化酶試紙、HB8484假單胞菌產(chǎn)熒光色素培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌      HB8300芽孢染色液

白色念珠菌      HB7015念球菌顯色培養(yǎng)基、HB0236-1 1%吐溫80-玉米瓊脂培養(yǎng)基

黑曲霉          HB4701改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基

生孢梭菌        HB0124-1哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、HB0124-1a硫酸慶大霉素(4mg/支)、HB8650 3%過氧化氫試液

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