磁珠是高通量測序過程*產(chǎn)品，通過磁顆?；钚曰鶊F(tuán)在一定條件下可與核酸結(jié)合和解離的原理，將樣本中目的片段分離?？蓪崿F(xiàn)對核酸樣本的高通量自動化操作，廣泛應(yīng)用于基因測序以及分子診斷領(lǐng)域。

背景篇

磁珠的發(fā)明構(gòu)想初來自于挪威科技大學(xué)的化學(xué)家John Ugelstad，他在1976年以聚苯乙烯為主要材料，制作出均勻磁化的球體粒子。1979年Vogelstein等報道在高濃度典化鈉存在的條件下，玻璃粉末作為吸附劑用于從瓊脂糖凝膠中提取DNA片段，而后基于硅膠和其他具有親水性表面載體的固相核酸純化技術(shù)廣泛發(fā)展起來。而基于磁性微粒的核酸純化方法就是其中的一種。

結(jié)構(gòu)篇

雖然到目前為止納米級別的磁珠各式各樣，表面性質(zhì)不同，分離的原理也不盡相同，但其材料組成和基本的結(jié)構(gòu)并無太大的差異。基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)分為三層，內(nèi)層的是聚苯乙烯，第二層包裹磁性物質(zhì)（通常是Fe₃O₄），外層是修飾的官能團(tuán)（如羧基）。其中官能團(tuán)能與核酸結(jié)合，表面基團(tuán)不同，下游的應(yīng)用也不盡相同，如核酸提取，純化，生物素捕獲等。

圖 磁珠結(jié)構(gòu)示意圖

原理篇

商業(yè)化磁珠產(chǎn)品體系一般包含：磁珠、聚乙二醇（PEG）、鹽離子等?；赟PRI(Solid Phase Reversible Immobilization )技術(shù)， DNA在一定濃度的PEG存在條件下，NaCl或MgCl₂促進(jìn)條件下，DNA分子構(gòu)象會發(fā)生急劇變化，會暴露出磷酸骨架上大量的帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，與表面帶負(fù)電荷的羧基磁珠結(jié)合。目前認(rèn)為這種負(fù)負(fù)電荷間的作用是由于帶正電荷的鹽離子的作用（如Na⁺）。帶負(fù)電磷酸基團(tuán)借由解離的鹽離子（如Na⁺）與羧基形成離子橋，使DNA被特異性吸附到羧基磁珠表面。利用磁珠的磁性，可通過外加磁場進(jìn)行收集洗脫。

圖 磁珠吸附DNA原理示意圖

操作篇

受益于高通量測序技術(shù)的發(fā)展，磁珠也憑借其高通量，適用于自動化的特點備受推崇，廣泛用于NGS文庫構(gòu)建中DNA純化/雙輪分選（片篩）。

DNA純化的目的在于去除不想要的片段，由于磁珠優(yōu)先吸附大片段，因而可通過一定比例的磁珠吸附特定大小以上的片段，丟棄上清（去除非目標(biāo)片段）后將磁珠吸附的DNA洗脫回收。常用于小片段如接頭二聚體/引物二聚體的去除。

圖 DNA純化操作示意圖

DNA雙輪分選（片篩）目的在于從片段化DNA中選擇特定區(qū)域的DNA片段大小。由于磁珠優(yōu)先吸附大片段，因而需通過兩輪磁珠操作進(jìn)行分選。以分選450-550 bp的片段范圍為例：首先輪磁珠吸附550 bp以上片段，此時棄磁珠留上清，則上清中片段為550 bp以下的片段。第二輪取磁珠吸附450 bp以上（550 bp以下）磁珠，此時棄上清，再將磁珠上的目的片段洗脫回收。常用于NGS文庫構(gòu)建片段分選（片篩）。

圖 DNA雙輪分選操作示意圖

結(jié)果分析篇

1. 磁珠回收效率

   DNA樣本經(jīng)磁珠純化后會有部分樣本的損失，磁珠回收效率可評估磁珠的回收能力。具體可通過計算得出：回收效率=（純化后的DNA質(zhì)量/Input DNA質(zhì)量）×100%。

   以下表為例，相同的比例條件下：測試人1測試A樣本回收效率=153.25/169.5=90.41%，同理可計算其他樣本的回收效率。

表 磁珠回收效率計算

【注】：磁珠測試數(shù)據(jù)來源于上海某生物公司, 表格中A為AMPure XP磁珠；B、C、D分別是翊圣磁珠三個不同批次。

2. 磁珠分選精度

   由于二代測序段短讀長的局限性，因而終的NGS文庫需滿足一定的長度要求。因而NGS建庫中可能會分選特定長度區(qū)間的片段，滿足上機(jī)需求。分選精度則是評估不同的磁珠投入比例分選得到的片段大小。一般以Agilent 2100儀器檢測。

   在特定磁珠比例（0.45×/0.15×）條件下，不同樣本分選后片段分布范圍集中在同一位置。較好的分選效果圖應(yīng)該是頂部窄而圓潤的獨峰。

【注】：數(shù)據(jù)結(jié)果來源于上海某生物公司。值得注意的是：不同廠家磁珠buffer的不同，導(dǎo)致相同比例條件下分選得到的片段范圍也不一致，使用前請按照對應(yīng)的磁珠說明書選擇合適的分選比例進(jìn)行操作。

注意事項篇

1. 磁珠使用前需平衡至室溫，否則影響實驗效果（PEG分離效果易受pH、溫度等影響）；

2. 用于磁珠洗脫的80%無水乙醇需現(xiàn)用現(xiàn)配；

3. 長度分選時建議初始體積≥100 μL，不足時請用超純水補(bǔ)齊（樣品體積太小，將導(dǎo)致移液誤差增大，進(jìn)而影響分選的準(zhǔn)確性）；

4. 磁珠分選時特別注意輪分選后棄含大片段的磁珠，第二輪棄含小片段的上清；

5. 輪分選轉(zhuǎn)移上清時，避免吸到磁珠，引起大片段殘留；

6. 分選/純化產(chǎn)物如需長時間存放請用TE buffer洗脫保存。

FAQ篇

看起來很簡單的純化/分選實驗，卻在實際實驗中有各種意外的情況。那關(guān)于產(chǎn)品選擇以及使用方面我們實際操作中有什么需要注意的事項呢？

產(chǎn)品應(yīng)用：

1. 磁珠可以吸附ssDNA嗎？

A：可以回收單鏈DNA，具體性能沒有測試過。附圖是Beckman磁珠回收單鏈DNA的數(shù)據(jù)，可以作為參考。

2. 分選磁珠可以純化gDNA嗎？

A:翊圣分選磁珠測試過大20kb的片段，回收率>90%?；蚪M DNA 未測試過，測試時，由于大DNA與磁珠結(jié)合的非常緊，建議盡量增加洗脫液體積，避免干燥時間過久。

3. 磁珠的DNA結(jié)合能力怎么樣？

A：在目前的磁珠體系中，磁珠的吸附能力均為過飽和，客戶不必?fù)?dān)心磁珠結(jié)合能力不足的情況。根據(jù)已知的報道，每1 μL磁珠可以結(jié)合7 μg DNA。

4. 使用磁珠吸附小片段的時候，大片段也會吸附上來嗎？

A: 磁珠優(yōu)先吸附大片段，增大磁珠投入量時，磁珠會在吸附大片段的基礎(chǔ)上增強(qiáng)吸附小片段的能力。舉例說明：

參考磁珠純化分選表，100 μL樣本，加入80 μL磁珠Cat#12601,此時磁珠上吸附的是>350 bp的片段，但是，當(dāng)磁珠投入量至100 μL時，磁珠上吸附的是>200 bp的片段。

產(chǎn)品使用效果：

1. 使用磁珠分選/純化之后，還有小片段殘留是怎么回事？

A: 小片段殘留大部分是接頭二聚體/引物二聚體。若純化，降低磁珠比例；若分選：可適當(dāng)降低二輪磁珠比例可有效改善此類情況。

2. 磁珠回收率低可能的原因是什么？

A：1）磁珠與DNA混勻不充分，未能充分吸附。建議反應(yīng)體系充分混勻；

2）磁珠比例不對，建議按照說明書進(jìn)行選擇合適的比例；

3）孵育時間不足，保證孵育時間至少5 min；

4）磁珠分選時，二輪磁珠吸附的時候吸到磁珠。可在200 μL 槍頭前串聯(lián) 10μL槍頭用于移液，可防止吸到磁珠；

5）磁珠洗滌時的乙醇非現(xiàn)配，導(dǎo)致乙醇濃度過低，建議乙醇濃度不低于70%；

6）干燥過度：磁珠長時間干燥導(dǎo)致表面龜裂，DNA難以洗脫，得率降低；建議干燥時間不宜過長，表面剛出現(xiàn)龜裂即可；

7）洗脫液體積不足：終洗脫液應(yīng)*覆蓋管內(nèi)磁珠。

產(chǎn)品儲存：

1. 磁珠不小心放在低溫（-20℃）凍了一段時間，還能用嗎？

A：不能使用，低溫會破壞磁珠表面集團(tuán)的修飾，影響磁珠回收性能。

關(guān)于我們

翊圣生物是專注于分子酶原料創(chuàng)新研發(fā)的高新技術(shù)企業(yè)。而磁珠是NGS文庫構(gòu)建*產(chǎn)品。根據(jù)市場磁珠需求，YEASEN集中專業(yè)人員，致力于磁珠系列產(chǎn)品的創(chuàng)新開發(fā)，目前已經(jīng)擁有多款核酸純化類磁珠產(chǎn)品，可應(yīng)用于高通量測序與核酸純化。

圖 翊圣磁珠系列產(chǎn)品

磁珠產(chǎn)品選擇指南

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