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DNA合成儀功能原理使用方法日常維護基本結(jié)構(gòu)

來源：蘇州亞凡生物技術(shù)有限公司 2011年04月01日 10:56

DNA合成儀

設(shè)計用于合成結(jié)構(gòu)上類似DNA或RNA的寡核苷酸的自動化儀器。一般應(yīng)用于固相合成法，每次將一個核苷酸加到所接長的寡核苷酸鏈上，加入每一個核苷酸都利用相同的化學(xué)反應(yīng)與相應(yīng)的嘌呤或嘧啶堿基衍生物作用。所用化學(xué)反應(yīng)和操作細節(jié)隨不同的儀器而改變，zui廣泛應(yīng)用的方法是DNA合成的磷酸酰胺法。

功能及原理

基本組成結(jié)構(gòu)和性能

（一）壓力系統(tǒng)

　　系統(tǒng)壓力由超純氬（99．998％）提供。氬氣密度高、氧污染少，因此高壓氬氣常常用來啟動真空輔助系統(tǒng)及供給合成儀調(diào)節(jié)器。進入合成儀的氬氣通過10txm的顆粒過濾器后送到3個壓力調(diào)節(jié)器，調(diào)節(jié)器將氬氣輸送到特定的壓力閥來增加試劑和溶劑瓶的壓力。調(diào)節(jié)器也將氬氣供給柱子和試劑閥體。

（二）試劑和溶劑儲液瓶

　　儀器上每個儲液瓶都有特定的位置，儲液瓶蓋座和儀器上所有號碼相對應(yīng)，儀器上的位置或儲液瓶的編號都是1—8（5個堿基的儀器為1～5）、9、10、11、12、14、15、18和19（配有自動分析的儀器）。將1～8號瓶向上推，在聚四氟乙烯插塞周圍有一“O”形環(huán)，每一瓶頸內(nèi)部形成一氣密塞。因為試劑輸送系統(tǒng)是要加壓的，所以要使瓶

　　子與儀器之間的密封塞保持氣密性。選擇合適的一次性塞及在瓶上加“O”形環(huán)可以加強氣密性。

（三）壓力管路及輸送管路

　　每個瓶子都有一個氬氣壓力管道及輸送管道進入瓶蓋插塞，對于亞磷酰胺，1—8號瓶其壓力管道也作為排氣管。氬氣管要保持在液體水平以上，而輸送管卻伸到瓶的底部。當閥門正確設(shè)置打開時，儲液瓶上部空間由氬氣加壓，液體被推進輸送管，流到其目的地。

（四）亞磷酰胺瓶排氣

　　除了加壓外，亞磷酰胺瓶都是用壓力排氣管排氣的。把亞磷酰胺放人儀器前，要用氬氣排除空氣使其凈化。凈化是通過輸送管輸送氣體，當氣體輸送到瓶內(nèi)時，空氣經(jīng)壓力排氣管排出。這是由瓶子更換步驟自動完成的。廢液瓶是輸送系統(tǒng)的低壓側(cè)，必須將出口與大氣相通。要確保排氣管通到通風(fēng)柜。如果排氣管阻塞，將會產(chǎn)生反壓，試劑和溶劑的輸送會受到抑制。

（五）輸送閥塊

　　試劑輸送系統(tǒng)包括兩個試劑閥塊（8堿基儀器有3個）及2個或4個柱閥塊。閥塊控制氣體和化學(xué)試劑流人柱子及出口。除亞磷酰胺和四唑以外，試劑和溶劑都被同時輸送到所有活化柱。當有多個活化柱時，對流速的細微變化，以自動調(diào)節(jié)每個柱子的輸送次數(shù)來補償。每一個5—端口柱閥塊將流出物導(dǎo)人廢液口、DMT收集口，或DNA收集瓶，它也控制用于除去或沖洗柱內(nèi)和柱閥塊內(nèi)的試劑的氬氣。

（六）輔助真空

　　對于閥塊的適當運行，關(guān)鍵是隔膜形成一個圓頂小空隙，每次電磁閥打開時，抽氣泵為每個閥塊提供了輔助真空，輔助真空在隔膜的螺線管一側(cè)形成，使隔膜形成一圓頂空隙。

（七）柱子

　　起始結(jié)合在載體上的核苷酸是裝在一次性的柱子中，除柱體外，還有2個固定過濾板和2個接頭，所有的部件都由惰性材料制成。固定過濾板是多孑L性聚苯乙烯固定在兩端蓋子中。人口和出口都是母路厄氏（1uer）接頭，與儀器的公路厄氏接頭配對。柱子是對稱的（沒有頂端和底部、前后之分），可以以任何方式與公路厄氏接頭相連接。每一個柱子都用顏色編號，表示不同的起始核苷酸，以及有一個*的連續(xù)順序號碼。正常的流路是從底部進入，通過向上輸送液體，使CPG顆粒上升并保持懸浮狀態(tài)。溶劑和試劑的流速已經(jīng)設(shè)置好，能使顆粒適當?shù)鼗旌稀?

（八）路節(jié)流閥

　　試劑通過底部的luer接頭，流到柱子，如果沒擰上下面的一個luer接頭，應(yīng)會在一個圓柱形的玻璃流路節(jié)流閥上發(fā)現(xiàn)。試劑通過流路節(jié)流閥中一個很小的通道流到柱子。小量的試劑可以在流路節(jié)流閥中結(jié)晶，長期這樣會造成流路阻塞。

（九）廢液和排氣

　　大多數(shù)化學(xué)試劑輸送的zui終點是廢液瓶，廢液瓶是一個空立著的10L的聚苯乙烯容器，可放在合成儀附近的地板上或放在低于儀器的附近工作臺上。排氣管將廢氣導(dǎo)人適當?shù)呐艢庋b置，如排煙罩

（十）電導(dǎo)池

　　電導(dǎo)流動池是為了測定在每個DNA合成循環(huán)內(nèi)釋放的DMT陽離子的總電導(dǎo)而設(shè)計的。流動池是由一空隙隔開的兩個電極組成，在空隙之間應(yīng)用一小電壓。DMT陽離子流過電導(dǎo)池時起電導(dǎo)作用。

（十一）電池

　　DNA合成儀一般帶有鋰電池，可以使用幾年。當主電源斷開時，所有的合成參數(shù)都被保留下來。這些參數(shù)包括儲存的DNA序列，用戶設(shè)定的循環(huán)、步驟和功能，以及瓶子使用資料等。如果正在合成中電源出現(xiàn)故障，合成將被中斷，只有主電源恢復(fù)時合成才可重新開始。電池還保持合成儀內(nèi)部的時鐘計時。

（十二）控制器

　　控制器指導(dǎo)和初始合成儀的所有活動，它的主要部分是軟件、微處理機、顯示屏幕、鍵板及相關(guān)的電子部件。軟件控制合成的所有必要操作并由微處理機來解釋和執(zhí)行。軟件儲存在一個可取出的存儲卡中，這個存儲卡插在儀器的背面。合成信息顯示在液晶顯示屏上，通過選擇鍵板上的鍵可與儀器交流。軟件是“菜單驅(qū)動”，通過按適當?shù)逆I，可選擇一項，給予指令。為了完成自動合成，軟件應(yīng)用一個包含一系列步驟的循環(huán)來完成全部化學(xué)反應(yīng)。

使用方法操作步驟

　　以亞磷酰胺寡核苷酸合成為例介紹該類儀器的一般操作步驟。亞磷酰胺DNA合成的試劑有：保護堿基的5／—DMT，A、G、C、T亞磷酰胺單體，四唑偶聯(lián)催化劑，乙酐，N—甲基咪唑封閉試劑，三氯乙酸（TCA）脫保護溶液，12氧化混合物，乙腈清洗溶劑，氨水切除溶液。使用步驟如下：

　　1）仔細檢查合成儀上所有試劑瓶中的試劑量，必要時換掉試劑瓶，特別注意乙腈的量，因為該溶劑用量較大。

　　2）將標記好的清潔的收集瓶裝在合成儀上。

　　3）將要合成的DNA序列輸入合成儀。

　　4）檢查選擇的合成步驟是否正確。

　　5）選擇結(jié)束方法：TritylOffAuto是儀器的原始狀態(tài)，若打算以5，—DMT基團連接純化寡核苷酸，將其轉(zhuǎn)變?yōu)門ritylOnAuto結(jié)束狀態(tài)。

　　6）選擇結(jié)束方法，一般為系統(tǒng)的原始狀態(tài)。

　　7）在每個柱監(jiān)視器的Username下，輸入你所希望的保存名字。

　　8）以代碼代替相應(yīng)的DNA序列標記每一個收集瓶。

　　9）打印出每一個柱設(shè)置的詳細資料。

　　10）檢查打印出來的資料是否正確。

　　11）運行StartColumn步驟檢查每一個柱的位置，確保合成儀上合成柱處于正確的位置。

　　12）檢查連接在合成儀上的溶劑殘留（廢液瓶）是否充滿。

　　13）如果分部收集器用來收集每個DMT脫保護步驟的流出物，確保試管充分清潔干凈，并打開分部收集器，確保DMT廢液管路通向分部收集器。

　　14）啟動循環(huán)，運行開始程序清洗試劑管路，除去原來的試劑。

　　注意：TritylOnAuto表示在合成寡核苷酸的5’端核苷酸帶有一個DMT，并將其從固相載體上切下來，儲存在收集瓶中；TritylOffAuto表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸沒有保護基團，將其從固相載體上切下來，儲存在收集瓶中；TritylOnManual表示合成寡核苷酸的5’端核苷酸帶有一個DMT，寡核苷酸沒有從固相載體上切下來，而是保留在合成柱中；TritylOffManual表示在合成寡核苷酸的5，端核苷酸沒有保護基團，寡核苷酸沒有從固相載體上切下來，而是保留在合成柱中。

日常維護

　　1．瓶塞“O”形環(huán)

　　一月檢查一次“O”形環(huán)，zui少1年更換1次。將新的備用“O”形環(huán)與儀器上的相比較，如果在“O”形環(huán)上出現(xiàn)白色沉淀，用棉花蘸取乙腈，進行清洗。更換“O”形環(huán)的步驟如下：用止血鉗夾住“O”形環(huán)，從槽中取下（或用牙簽鉤下），注意不要損壞托住“O”形環(huán)的白色聚氟乙烯插塞（tefloninsert）；確保插塞上沒有顆粒后，用手指將新“O”形環(huán)推進槽，進行壓力實驗。

　　2．儲液瓶

　　瓶子都要放在亞磷酰胺及儲液瓶位置上，并保持氬氣壓力以及管路清潔。

　　3．流路節(jié)流閥

　　為了防止阻塞，節(jié)流閥應(yīng)該1個月清洗1次，清洗時，先在水中煮沸15min，然后再在甲醇中超聲波清洗。

不同型號DNA/RNA合成儀的特點與性能簡介

　　PE公司391型DNA／RNA合成儀

　　美國PE公司應(yīng)用生物系統(tǒng)部（原美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，ABl）于1982年推出了世界上*臺全自動DNA合成儀。391型DNA／RNA合成儀可滿足不同科研工作者對高產(chǎn)率、高純度DNA、RNA的需求。該儀器采用固相亞磷酰胺合成法，配有多種規(guī)格合成柱，可滿合成大量的長片段DNA；合成試劑純度>99.8％；每步偶聯(lián)效率>98．5％，保證一般情況下可合成100bp以上核酸片段，而且合成的片段純度高、產(chǎn)率高；每步循環(huán)時間5—6min，合成時間短；可以合成混合引物或探針，即保證在引物某一位點各種堿基有同等摻人率；引物可使用寡聚核苷酸純化柱純化；采用快速脫保護試劑，可在1h內(nèi)完成堿基脫保護。

　　美國貝克曼公司01ig01000系列DNA合成儀

　　Olig01000系列采用星型射流設(shè)計，可節(jié)省試劑用量達50％；可自由選擇30、200和1000nmol合成量；每個循環(huán)只需2min，裂解／脫保護步驟所需時間短，可在1h內(nèi)合成約17個堿基的引物；堿基試劑采用防潮雙元包裝，能迅速無誤稀釋核苷酸，具有良好的偶聯(lián)效率；儀器配有自動監(jiān)控系統(tǒng)，保證DNA準確合成；合成產(chǎn)物純度較高，無需純化，可直接應(yīng)用于大多數(shù)的研究。

　　現(xiàn)在國內(nèi)比較常見的高通量DNA合成儀是ABI3900，MM192和OLIGO192，前者一次可合成48條，后二者一次可以合成192條。

發(fā)展

　　當前DNA合成儀的主要生產(chǎn)廠商都致力于機器性能的完善和應(yīng)用領(lǐng)域的開拓以及率、高產(chǎn)率的儀器的開發(fā)與研究。

　　中國臺灣科學(xué)委員會“基因醫(yī)藥衛(wèi)生科技研究計劃”中的基因生物技術(shù)組已經(jīng)成功研發(fā)**臺高密度復(fù)制DNA合成儀，可以同時合成384條不同DNA，每日可合成768條DNA，并可以配合聚合酶連鎖反應(yīng)裝置，大量復(fù)制各種基因，不但節(jié)省時間，也可節(jié)省大量人力，這部機器能復(fù)制動物、人體、植物的基因甚至是防偽基因。

　　由于人們所需要的大部分核酸的堿基對數(shù)量遠遠超過目前DNA合成儀可以合成的zui長核酸鏈的堿基對數(shù)量，因此還需要不斷改善合成工藝才能得到較長的核酸分子。

　　為了能夠在將來改變酶的結(jié)構(gòu)，使其在工業(yè)上更有價值；改變蛋白質(zhì)和多肽的結(jié)構(gòu)，制備新藥物；并開拓有關(guān)人類疾病和遺傳調(diào)控的新領(lǐng)域，化學(xué)合成DNA在這一過程中將起關(guān)鍵性作用。根據(jù)不同化學(xué)方法研制的DNA合成儀也將不斷涌現(xiàn)，能夠突破現(xiàn)有核酸合成的堿基對數(shù)量限制，大量節(jié)省人力、物力、財力。

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