第四節(jié) 肌組織細(xì)胞培養(yǎng)

各種肌組織均可用于培養(yǎng)，以心肌和骨骼肌較實(shí)用。

（－）骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)

1、出生1一2天的乳鼠，引頸處死。

2、無菌取大腿肌組織，切成0.3一0.5cm2小塊后，用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化，無菌紗網(wǎng)或紗布濾過。

3、計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度。

4、快接種量2×106/皿入培養(yǎng)基培養(yǎng)。

5、培養(yǎng)基內(nèi)含10%小牛血清，可加1%的胎汁以促進(jìn)分化。

接種在膠原或膠原的底物上能促進(jìn)細(xì)胞分化，明膠配置：用Hanks液配成0.01%明膠。

該細(xì)胞接種率約50%，細(xì)胞生長開始呈紡錘形，培養(yǎng)50－52小時(shí)后出現(xiàn)融合形成肌細(xì)胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止，此時(shí)可觀察到橫紋，一般在融合后二、三天內(nèi)能見到收縮現(xiàn)象。

（二）心肌細(xì)胞培養(yǎng)

心肌細(xì)胞是zui早的培養(yǎng)材料，Carrel曾長期培養(yǎng)過心肌組織，至今心肌仍不失為好的培養(yǎng)物，zui常用的是雞胚心肌。

心肌比較容易培養(yǎng)和生長，可用懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法，均可獲良好的效果。取心室肌培養(yǎng)較好，原代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形，培養(yǎng)成功時(shí)，一周后可見節(jié)律性收縮現(xiàn)象。

第五節(jié) 巨噬細(xì)胞培養(yǎng)

巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。巨噬細(xì)胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進(jìn)行純化。巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì)胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養(yǎng)，難以長期生存。

巨噬細(xì)胞也建有無限細(xì)胞系，大多來自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均獲惡性，培養(yǎng)中呈巨噬細(xì)胞形態(tài)和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。

培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各樣方法和各種來源來獲取細(xì)胞，以小鼠腹腔取材法zui為實(shí)用，其法如下：

1、實(shí)驗(yàn)前三天，向小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫羥乙酸肉湯lml（勿注入腸內(nèi)?。?，以刺流產(chǎn)生大量的巨噬細(xì)胞。

2、引頸處死小鼠。

3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3－5秒。

4、置動(dòng)物于解剖臺(tái)，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側(cè)，暴露出腹膜壁。

5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同時(shí)用手指從兩側(cè)壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內(nèi)流動(dòng)。

6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側(cè)．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。

7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。

8、4℃下250g離心10分鐘后，去上清，加10ml Eagle培養(yǎng)基。

9、計(jì)數(shù)細(xì)胞。每只鼠可產(chǎn)生20一30×106細(xì)胞，其中90%為巨噬細(xì)胞。

10、以3×105個(gè)貼附細(xì)胞/平方厘米接種。

11、接種數(shù)小時(shí)后，除去培養(yǎng)液，可去除其它白細(xì)胞，純化培養(yǎng)細(xì)胞，用Eagle液沖洗1一2次，再加新Eagle培養(yǎng)液置CO2溫箱中。 

第六節(jié) 腎小球分離、移植培養(yǎng)

SD大鼠頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡1～2分鐘，2次，置超凈臺(tái)內(nèi)，打開腹腔取出腎臟剪碎，置含Hank's液的無菌培養(yǎng)皿洗滌，置80目不銹鋼篩網(wǎng)上。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產(chǎn)物微小組織透過篩網(wǎng)，濾過組織Hank's液混合物用吸管吸至120目不銹鋼篩網(wǎng)，濾過，去小組織塊，濾過物吸至200目不銹鋼篩網(wǎng)，輕輕濾過，Hank's液洗滌1次，收集網(wǎng)上腎小球，鏡下觀察為分離良好的腎小球。

腎小球用0.2%胰酶、0.1%膠原酶，37℃消化20分鐘，加血清終止胰酶反應(yīng)，離心除去膠原酶。處理過的腎小球計(jì)數(shù)后接種至24孔培養(yǎng)板或25ml培養(yǎng)瓶，使腎小球大于60個(gè)/cm2，加培養(yǎng)基5～10ml（培養(yǎng)基組成：F12—3T3上清1：1；5%馬血清；2.5%胎牛血清；胰島素5μg/ml；25ng/ml氫化可d松；5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白；25ng/ml前列腺素E1；甲狀腺素0.02ng/ml；D-纈氨酸150ng/ml）腎小球培養(yǎng)8～10天，去除腎小球未生長組分，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，形態(tài)學(xué)觀察：細(xì)胞生長成單層多角型細(xì)胞，直徑約100μm。

第七節(jié) 裸小鼠移植瘤單細(xì)胞分離培養(yǎng)

無菌條件下取出小鼠移植瘤組織，剪成1mm3小塊，用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時(shí)，再加等體積0.2%胰酶消化5～8分鐘，在消化過程中用吸管吹打組織塊或用自制裝置（分別作為加樣和收集器的兩個(gè)注射器中間加一小濾器連接而成，濾器中間墊兩層絲質(zhì)材料以隔斷組織塊與單細(xì)胞）來回推動(dòng)注射器吹打組織以分離單細(xì)胞，終止酶消化方法同上。

常規(guī)方法接種培養(yǎng)收獲細(xì)胞。