第三節(jié) 大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的操作方式

深層培養(yǎng)可分為：分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式、連續(xù)式和灌注式五種。

一、分批式培養(yǎng)（batch culture） 是細胞規(guī)模培養(yǎng)發(fā)展進程中較早期采用的方式，也是其它操作方式的基礎(chǔ)。該方式采用機械攪拌式生物反應(yīng)器，將細胞擴大培養(yǎng)后，一次性轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中其體積不變，不添加其它成分，待細胞增長和產(chǎn)物形成積累到適當?shù)臅r間，一次性收獲細胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基的操作方式。

該方式的特點:

操作簡單。培養(yǎng)周期短，染菌和細胞突變的風險小。反應(yīng)器系統(tǒng)屬于封閉式，培養(yǎng)過程中與外部環(huán)境沒有物料交換，除了控制溫度、pH值和通氣外，不進行其他任何控制，因此操作簡單，容易掌握；

直觀反映細胞生長代謝的過程。因培養(yǎng)期間細胞生長代謝是在一個相對固定的營養(yǎng)環(huán)境，不添加任何營養(yǎng)成分,因此可直觀的反映細胞生長代謝的過程,是動物細胞工藝基礎(chǔ)條件或"小試"研究常用的手段；

可直接放大。由于培養(yǎng)過程工藝簡單，對設(shè)備和控制的要求較低，設(shè)備的通用性強，反應(yīng)器參數(shù)的放大原理和過程控制，比較其它培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，在工業(yè)化生產(chǎn)中分批式培養(yǎng)操作是傳統(tǒng)的、常用的方法，其工業(yè)反應(yīng)器(Genetech)規(guī)?？蛇_12000L。

分批培養(yǎng)過程中，細胞的生長分為五個階段：延滯期、對數(shù)生長期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期，見圖1。分批培養(yǎng)的周期時間多在3-5天，細胞生長動力學表現(xiàn)為細胞先經(jīng)歷對數(shù)生長期（48-72h）細胞密度達到zui高值后，由于營養(yǎng)物質(zhì)耗劫或代謝毒副產(chǎn)物的累積細胞生長進入衰退期進而死亡，表現(xiàn)出典型的生長周期。收獲產(chǎn)物通常是在細胞快要死亡前或已經(jīng)死亡后進行。

二、流加式培養(yǎng)（feeding culture）

1、流加式培養(yǎng)是在批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，采用機械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)細胞或以懸浮微載體培養(yǎng)貼壁細胞，細胞初始接種的培養(yǎng)基體積一般為終體積的1/2～1/3，在培養(yǎng)過程中根據(jù)細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流加濃縮的營養(yǎng)物或培養(yǎng)基，從而使細胞持續(xù)生長至較高的密度，目標產(chǎn)品達到較高的水平，整個培養(yǎng)過程沒有流出或回收，通常在細胞進入衰亡期或衰亡期后進行終止回收整個反應(yīng)體系，分離細胞和細胞碎片，濃縮、純化目標蛋白。

2、流加培養(yǎng)特點：

流加培養(yǎng)依據(jù)細胞生長速率、營養(yǎng)物消耗和代謝產(chǎn)物抑制情況，流加濃縮的營養(yǎng)培養(yǎng)基。流加的速率與消耗的速率相同，按底物濃度控制相應(yīng)的流加過程，保證合理的培養(yǎng)環(huán)境與較低的代謝產(chǎn)物抑制水平。

培養(yǎng)過程以低稀釋率流加，細胞在培養(yǎng)系統(tǒng)中停留時間較長，總細胞密度較高，產(chǎn)物濃度較高。

流加培養(yǎng)過程須掌握細胞生長動力學，能量代謝動力學，研究細胞環(huán)境變化時的瞬間行為。流加培養(yǎng)細胞培養(yǎng)基的設(shè)計和培養(yǎng)條件與環(huán)境優(yōu)化，是整個培養(yǎng)工藝中的主要內(nèi)容。

在工業(yè)化生產(chǎn)，懸浮流加培養(yǎng)工藝參數(shù)的放大原理和過程控制，比較其它培養(yǎng)系統(tǒng)較易理解和掌握，可采用工藝參數(shù)的直接放大。

流加培養(yǎng)是當前動物細胞培養(yǎng)中占有主流優(yōu)勢的培養(yǎng)工藝，也是近年來動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)研究的熱點。流加培養(yǎng)中的關(guān)鍵技術(shù)是基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加濃縮的營養(yǎng)培養(yǎng)基。通常進行流加的時間多在指數(shù)生長后期，細胞在進入衰退期之前，添加高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)。可以添加一次，也可添加多次，為了追求更高的細胞密度往往需要添加一次以上，直至細胞密度不再提高；可進行脈沖式添加，也可以降低的速率緩慢進行添加，但為了盡可能的維持相對穩(wěn)定的營養(yǎng)物質(zhì)環(huán)境，后者采用較多；添加的成分比較多，凡是促細胞生長的物質(zhì)均可以進行添加。流加的總體原則是維持細胞生長相對穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，營養(yǎng)成分即不過剩而產(chǎn)生大量的代謝副產(chǎn)物造成營養(yǎng)利用效率下降而成為無效的利用；也不缺乏導(dǎo)致細胞生長抑制或死亡。

3、流加工藝中的營養(yǎng)成分主要分為三大類：

葡萄糖：葡萄糖是細胞的供能物質(zhì)和主要的碳源物質(zhì)，然而當其濃度較高是會產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，因而需要進行其濃度控制，以足夠維持細胞生長而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳。

谷氨酰胺：谷氨酰胺是細胞的供能物質(zhì)和主要的氮源物質(zhì)，然而當其濃度較高是會產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物氨，因而也需要進行其濃度控制，以足夠維持細胞生長而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳；

大規(guī)模培養(yǎng)中細胞凋亡主要由于營養(yǎng)物質(zhì)的耗竭或代謝產(chǎn)物的堆積引起，如谷氨酰胺的耗竭是zui常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。另外，動物細胞在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時，細胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。

氨基酸、維生素及其他：主要包括營養(yǎng)必需氨基酸、營養(yǎng)非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸；此外還包括其他營養(yǎng)成分如膽堿、生刺激因子。添加的氨基酸形式多為左旋氨基酸，因而多以鹽或前體的形式替代單分子氨基酸，或者添加四肽或短肽的形式。在進行添加時，不溶性氨基酸如胱氨酸、酪氨酸和色氨酸只在中性pH值部分溶解，可采用泥漿的形式進行脈沖式添加；其他的可溶性氨基酸以溶液的形式用蠕動泵進行緩慢連續(xù)流加。

4、流加式培養(yǎng)分為兩種類型：單一補料分批式培養(yǎng)和反復(fù)補料分批式培養(yǎng)。

單一補料分批式培養(yǎng)是在培養(yǎng)開始時投入一定量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，培養(yǎng)到一定時期，開始連續(xù)補加濃縮營養(yǎng)物質(zhì)，直到培養(yǎng)液體積達到生物反應(yīng)器的zui大操作容積，停止補加，zui后將細胞培養(yǎng)液一次全部放出。該操作方式受到反應(yīng)器操作容積的限制，培養(yǎng)周期只能控制在較短的時間內(nèi)。

反復(fù)補料分批式培養(yǎng)是在單一補料分批式操作的基礎(chǔ)上，每個一定時間按一定比例放出一部分培養(yǎng)液，是培養(yǎng)液體積始終不超過反應(yīng)器的zui大操作容積，從而在理論上可以延長培養(yǎng)周期，直至培養(yǎng)效率下降，才將培養(yǎng)液全部放出。 

三、半連續(xù)式培養(yǎng)（semi-continuous culture）

1、半連續(xù)式培養(yǎng)又稱為重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。采用機械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)形式。在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，每間隔一段時間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補足到原有體積，使反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變。

這種類型的操作是將細胞接種一定體積的培養(yǎng)基，讓其生長至一定的密度，在細胞生長至zui大密度之前，用新鮮的培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物，每次稀釋反應(yīng)器培養(yǎng)體積的1/2~3/4，以維持細胞的指數(shù)生長狀態(tài)，隨著稀釋率的增加培養(yǎng)體積逐步增加?；蛘咴诩毎鲩L和產(chǎn)物形成過程中，每隔一定時間，定期取出部分培養(yǎng)物，或是條件培養(yǎng)基，或是連同細胞、載體一起取出，然后補加細胞或載體，或是新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)進行培養(yǎng)的一種操作模式。剩余的培養(yǎng)物可作為種子，繼續(xù)培養(yǎng)，從而可維持反復(fù)培養(yǎng)，而無需反應(yīng)器的清洗、消毒等一系列復(fù)雜的操作。在半連續(xù)式操作中由于細胞適應(yīng)了生物反應(yīng)器的培養(yǎng)環(huán)境和相當高的接種量，經(jīng)過幾次的稀釋、換液培養(yǎng)過程，細胞密度常常會提高。

2、半連續(xù)式特點：

培養(yǎng)物的體積逐步增加；

可進行多次收獲；

細胞可持續(xù)指數(shù)生長，并可保持產(chǎn)物和細胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)到很長時間。

該操作方式的優(yōu)點是操作簡便，生產(chǎn)效率高，可長時期進行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，可使細胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。在動物細胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。

四、連續(xù)式培養(yǎng)（continuous culture）

1、連續(xù)式培養(yǎng)是一種常見的懸浮培養(yǎng)模式，采用機械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。該模式是將細胞接種與一定體積的培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)，在細胞達zui大密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基；同時，含有細胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上講，該過程可無限延續(xù)下去。

2、連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點是反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達到恒定，細胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長。穩(wěn)定狀態(tài)可有效的延長分批培養(yǎng)中的對數(shù)生長期。在穩(wěn)定狀態(tài)下細胞所處的環(huán)境條件如營養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、pH值可保持恒定，細胞濃度以及細胞比生長速率可維持不變。細胞很少受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來的生理影響，特別是生物反應(yīng)器的主要營養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺，維持在一個較低的水平，從而使他們的利用效率提高，有害產(chǎn)物積累有所減少。然而在高的稀釋率下，雖然死細胞和細胞碎片及時清除，細胞活性高zui終細胞密度得到提高；可是產(chǎn)物卻不斷在稀釋，因而產(chǎn)物濃度并為提高；尤其是細胞和產(chǎn)物不斷的稀釋，營養(yǎng)物質(zhì)利用率、細胞增長速率和產(chǎn)物生產(chǎn)速率低下。

3、連續(xù)式培養(yǎng)不足：

由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較長，容易造成污染；

在長周期的連續(xù)培養(yǎng)中，細胞的生長特性以及分泌產(chǎn)物容易變異；

對設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高。

連續(xù)式培養(yǎng)操作使用的反應(yīng)器多數(shù)是攪拌式生物反應(yīng)器，也可以是管式反應(yīng)器。

4、連續(xù)式培養(yǎng)的特點：

細胞維持持續(xù)指數(shù)增長；

產(chǎn)物體積不斷增長；

可控制衰退期與下降期。

五、灌流式培養(yǎng)（perfusion culture）

1、灌流式培養(yǎng)是把細胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細胞增長和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。它與半連續(xù)式操作的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時，絕大部分細胞均保留在反應(yīng)器內(nèi)，而半連續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物時同時也取出了部分細胞。

灌流式培養(yǎng)常使用的生物反應(yīng)器主要有兩種形式。一種是用攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細胞，這種反應(yīng)器必須具有細胞截流裝置，細胞截留系統(tǒng)開始多采用微孔膜過濾或旋轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，zui近開發(fā)的有各種形式的沉降系統(tǒng)或透析系統(tǒng)。

中空纖維生物反應(yīng)器是連續(xù)灌流操作常用的一種。它采用的中空纖維半透膜，透過小分子量的產(chǎn)物和底物，截流細胞和分子量較大的產(chǎn)物，在連續(xù)灌流過程中將絕大部分細胞截留在反應(yīng)器內(nèi)；近年來中空纖維生物反應(yīng)器被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)物分泌性動物細胞的生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細胞生產(chǎn)單克隆抗體。

另外一種形式是固定床或流化床生物反應(yīng)器，固定床是在反應(yīng)器中裝配固定的籃筐，中間裝填聚脂纖維載體，細胞可附著在載體上生長，也可固定在載體纖維之間，靠上攪拌中產(chǎn)生的負壓，迫使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)填料，有利于營養(yǎng)成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細胞在載體中高密度生長。流化床生物反應(yīng)器是通過流體的上升運動使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進行反應(yīng)，適合于固定化細胞的培養(yǎng)。

2、灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點：

細胞截流系統(tǒng)可使細胞或酶保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細胞密度，一般可達107-109/ml，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量；

連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細胞穩(wěn)定的處在較好的的營養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低；

反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長，可提高生產(chǎn)率，目標產(chǎn)品回收率高；

產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時間短，可及時回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。

連續(xù)灌注培養(yǎng)是近年用于動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)分泌型重組治療性藥物和嵌合抗體及人源化抗體等基因工程抗體較為推崇的一種方式。應(yīng)用連續(xù)灌流工藝的公司有Genzyme, Genetic Institute, Bayer公司等。這種方法zui大困難是污染機率較高，長期培養(yǎng)中細胞分泌產(chǎn)品的穩(wěn)定性，規(guī)模放大過程中工程問題。

六、細胞工廠培養(yǎng) 細胞工廠(cell factory)是一種設(shè)計精巧的細胞培養(yǎng)裝置。它在有限的空間內(nèi)利用了zui大限度的培養(yǎng)表面，從而節(jié)省了大量的廠房空間,并可節(jié)省貴重的培養(yǎng)液。更重要的是，它可有效地保證操作的無菌性，從而避免因污染而帶來的原料、勞務(wù)和時間損失。它是對傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的革命。

丹麥NUNC公司生產(chǎn)的NUNC細胞工廠是目前應(yīng)用較多的細胞工廠系統(tǒng)?？捎糜谌缫呙纭慰寺】贵w或生物制藥等工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，特別適合于貼壁細胞，也可用于懸浮培養(yǎng)，在從實驗室規(guī)模進行放大時不會改變細胞生長的動力學條件，可提供1，2，10和40盤的規(guī)格使放大變得簡單易行，低污染風險，節(jié)省空間，培養(yǎng)表面經(jīng)測試保證zui有利于細胞貼附和生長。同時，與NUNC的細胞工廠操作儀結(jié)合使用，可全面實現(xiàn)細胞培養(yǎng)的自動化，從而大大地減低勞動強度和密集度。

這套系統(tǒng)使用很方便，可產(chǎn)生類似塑料培養(yǎng)瓶的效果。由組織培養(yǎng)級聚笨乙烯制成，使用后可隨意處理。其zui大缺點是：經(jīng)胰酶消化后，很難將細胞*洗出。 

第四節(jié) 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)用生物反應(yīng)器簡介

動物細胞培養(yǎng)技術(shù)能否大規(guī)模工業(yè)化、商業(yè)化，關(guān)鍵在于能否設(shè)計出合適的生物反應(yīng)器（bioreactor）。由于動物細胞與微生物細胞有很大差異，傳統(tǒng)的微生物反應(yīng)器顯然不適用于動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)。首先必須滿足在低剪切力及良好的混合狀態(tài)下，能夠提供充足的氧以供細胞生長及細胞進行產(chǎn)物的合成。

一、生物反應(yīng)器分類

目前，動物細胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器主要包括：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器、塑料袋增殖器、填充床反應(yīng)器、多層板反應(yīng)器、螺旋膜反應(yīng)器、管式螺旋反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器、流化床反應(yīng)器、中空纖維及其它膜式反應(yīng)器、攪拌反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器等。

按其培養(yǎng)細胞的方式不同，這些反應(yīng)可分為以下三類：

1、懸浮培養(yǎng)用反應(yīng)器：如攪拌反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器、氣升式反應(yīng)器；

2、貼壁培養(yǎng)用反應(yīng)器：如攪拌反應(yīng)器（微載體培養(yǎng)）、玻璃珠床反應(yīng)器、中空纖維反應(yīng)器、陶質(zhì)矩形通道蜂窩狀反應(yīng)器；

3、包埋培養(yǎng)用反應(yīng)器：如流化床反應(yīng)器、固化床反應(yīng)器。

二、攪拌罐生長反應(yīng)器 這是zui經(jīng)典、zui早被采用的一種生物反應(yīng)器。此類反應(yīng)器與傳統(tǒng)的微生物生物反應(yīng)器類似，真對動物細胞培養(yǎng)的特點，采用了不同的攪拌器及通氣方式。通過攪拌器的作用使細胞和養(yǎng)分在培養(yǎng)液中均勻分布，使養(yǎng)分充分被細胞利用，并增大氣液接觸面，有利于氧的傳遞?，F(xiàn)已開發(fā)的有：籠式通氣攪拌器、雙層籠式通氣攪拌器、槳式攪拌器、海般式攪拌器等。

三、氣升式生物反應(yīng)器

1979年應(yīng)用氣升式生物反應(yīng)器成功的進行了動物細胞的懸浮培養(yǎng)。氣升式生物反應(yīng)器的話優(yōu)點：

罐內(nèi)液體流動溫和均勻，產(chǎn)生剪切力小，對細胞損傷較??；

可直接噴射空氣供氧，因而氧傳遞率較高；

液體循環(huán)量大，細胞和養(yǎng)分都能均勻分布于培養(yǎng)液中；

結(jié)構(gòu)簡單，利于密封并降低了造價。

常用的氣升式反應(yīng)器有三種：內(nèi)循環(huán)式氣升式、外循環(huán)式氣升式、內(nèi)外循環(huán)式氣升式生物反應(yīng)器。

四、鼓泡式生物反應(yīng)器

與氣升式反應(yīng)器相類似，是利用氣體鼓泡來進行供氧及混合，其設(shè)計原理與氣升式生物反應(yīng)器也相同。

五、中空纖維生物反應(yīng)器 用途較廣，既可用于懸浮細胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細胞的培養(yǎng)。其原理是：模擬細胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)，利用反應(yīng)器內(nèi)數(shù)千根中空纖維的縱向布置，提供細胞近似生理條件的體外生長微環(huán)境，使細胞不斷生長。中空纖維是一種細微的管狀結(jié)構(gòu)，管壁為極薄的半透膜，富含毛細管，培養(yǎng)時纖維管內(nèi)灌流充以氧氣的無血清培養(yǎng)液，管外壁則供細胞黏附生長，營養(yǎng)物質(zhì)通過半透膜從管內(nèi)滲透出來供細胞生長；對于血清等大分子營養(yǎng)物，劃必須從管外灌入，否則會被半透膜阻隔不能被細胞利用；細胞的代謝廢物也可通過半透膜滲入管內(nèi)，避免了過量代謝物對細胞的毒害作用。

優(yōu)點是：

占地空間少；

細胞產(chǎn)量高，細胞密度可達109數(shù)量級；

生產(chǎn)成本低，且細胞培養(yǎng)維持時間長，適用于長期分泌的細胞。

六、生物反應(yīng)器的設(shè)計和放大 設(shè)計的總體考慮是：

①結(jié)構(gòu)嚴密，能耐受蒸汽滅菌，采用對生物催化劑無害和耐蝕材料制作，內(nèi)壁光滑*，內(nèi)部附件盡量減少，以維持純種培養(yǎng)需要；

②有良好的氣-液接觸和液-固混和性能和熱量交換性能，使質(zhì)量與熱量傳遞有效地進行；

③保證產(chǎn)物質(zhì)量和產(chǎn)量前提下，盡量節(jié)省能源消耗；

④減少泡沫產(chǎn)生，或附有消沫裝置以提高裝料系數(shù)，并有必要可靠的參數(shù)檢測和控制儀表并能與計算機聯(lián)機。 

生物反應(yīng)器的放大一種新的生物技術(shù)產(chǎn)品從實驗室到工業(yè)生產(chǎn)的開發(fā)過程中，會遇到生物反應(yīng)器的逐級放大問題，每一級約放大10～100倍。生物反應(yīng)器的放大，表面看來僅是一個體積或尺度放大問題，實際上并不是那么簡單。

反應(yīng)器放大研究雖已提出了不少方法，但還沒有一種是普遍都能適用的。目前還只能是半理論半經(jīng)驗的，即抓住反應(yīng)過程中的少量關(guān)鍵性參數(shù)或現(xiàn)象進行放大。

有關(guān)氧傳遞問題在生物反應(yīng)器中，氧的傳遞速率要滿足細胞對氧的攝取速率，并使反應(yīng)器中溶解氧的濃度CL要維持在一定水平上。這就是說，在穩(wěn)態(tài)情況下，供氧與需氧間存在下列關(guān)系：KLa(C*-CL)=r

此處， KLa為氧的傳遞系數(shù)；C*為相當氣相氧分壓的溶氧濃度，CL為培養(yǎng)液中溶氧濃度，r為攝氧率。

影響供氧的因素從上式可知r=KLa(C*-CL)；因此影響供氧的因素總體上講是KLa和C*-CL值。

要增大C*-CL，無非是增大C*值或降低CL值。增大C*的措施，有適當增加反應(yīng)器中操作壓力和增大氣相中的氧分壓兩個方法。在實際操作中，反應(yīng)器保持一定正壓，以防止大氣中的雜菌從軸封、閥門等處侵入，但在增加罐壓的同時，發(fā)酵代謝所產(chǎn)生的CO2也會更多地溶解于培養(yǎng)液而對發(fā)酵不利。至于CL值，一般不允許過分減小，因為細胞在生長中有一個臨界氧濃度，低于此臨界值，細胞的呼吸將受到抑制。

影響KLa的因素大致可分為三個方面：一是反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)，包括相對幾何尺寸的比例；二是操作條件，如攪拌功率或循環(huán)泵功率的輸入量，通氣量等；三是培養(yǎng)或發(fā)酵液的物理化學性質(zhì)，如流變特性，特別是其粘度或顯示粘度、表面張力、擴散系數(shù)、細胞形態(tài)、泡沫程度等。

生物反應(yīng)器中的傳熱在細胞培養(yǎng)和發(fā)酵過程中，熱量的釋放是普遍存在的。這是因為在培養(yǎng)或發(fā)酵過程中細胞與周圍環(huán)境的物質(zhì)產(chǎn)生新陳代謝，即發(fā)生異化（分解）作用和同化（合成）作用，而異化作用一般釋放能量，同化作用則是吸收能量。同化作用包括細胞生長、繁殖、產(chǎn)物形成所需能量來自細胞對培養(yǎng)基中的基質(zhì)及營養(yǎng)成分的異化。從熱力學角度講，異化所產(chǎn)生能量必然應(yīng)多于同化所需要能量，而多余的能量則轉(zhuǎn)化為熱能釋放到周圍環(huán)境中去。無論是涉及細胞或酶的反應(yīng)中，釋放出的熱量都應(yīng)及時移去，以免影響過程的正常進行，為此在生物反應(yīng)器中一般都附有冷卻裝置。

第五節(jié) 微載體培養(yǎng)技術(shù)（microcarrier culture technique）

一、微載體培養(yǎng)應(yīng)用 此技術(shù)于1967年被用于動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)。經(jīng)過三十余年的發(fā)展，該技術(shù)目前已漸日趨完善和成熟，并廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)疫苗、基因工程產(chǎn)品等。微載體培養(yǎng)是目前*的zui有發(fā)展前途的一種動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點，放大容易。目前微載體培養(yǎng)廣泛用于培養(yǎng)各種類型細胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如293細胞、成肌細胞、Vero細胞、CHO細胞。

使用較多的反應(yīng)器有兩種：貝朗公司的BIOSTAT?B反應(yīng)器，使用雙槳葉無氣泡通氣攪拌系統(tǒng)；NBS公司的CelliGen、CelliGen PlusTM和Bioflo3000反應(yīng)器，使用Cell-lift雙篩網(wǎng)攪拌系統(tǒng)。兩種系統(tǒng)都能實現(xiàn)培養(yǎng)細胞和收獲產(chǎn)物的有效分離。

二、微載體 是指直徑在60-250μm，能適用于貼壁細胞生長的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。自Van Wezel用DEAE-Sephadex A 50 研制的*種微載體問世以來，市場上出售的微載體商品的類型已經(jīng)達十幾種以上，包括液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。常用商品化微載體有三種：Cytodex1、2、3，Cytopore和Cytoline。

微載體的大?。涸龃髥挝惑w積內(nèi)表面積（S/F）對細胞的生長非常有利。使微載體直徑盡可能小，控制在100-200μm之間。

微載體的密度：一般為1.03-1.05g/cm2，隨著細胞的貼附及生長，密度可逐漸增大。

微載體的表面電荷：據(jù)研究，控制細胞貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質(zhì)。若電荷密度太低，細胞貼附不充分，但電荷密度過大，反而會產(chǎn)生“毒性”效應(yīng)。

三、微載體培養(yǎng)原理與操作

1、原理：其原理是將對細胞無害的顆粒-微載體加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。

貼壁依賴性細胞在微載體表面上的增殖，要經(jīng)歷黏附貼壁、生長和擴展成單層三個階段。細胞只有貼附在固體基質(zhì)表面才能增殖，故細胞在微載體表面的貼附是進一步鋪展和生長的關(guān)鍵。黏附主要是靠靜電引力和范德華力。細胞能否在微載體表面黏附，主要取決于細胞與微載體的接觸概率和相融性。

2、攪拌轉(zhuǎn)速：由于動物細胞無細胞壁，對剪切力敏感，因而無法靠提高攪拌轉(zhuǎn)速來增加接觸概率。通常的操作方式是：在貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時攪時停；數(shù)小時后，待細胞附著于微載體表面時，維持設(shè)定的低轉(zhuǎn)速，進入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，zui大速度75r/min。

3、細胞與微載體的相融性，是與微載體表面理化性質(zhì)有關(guān)。一般細胞在進入生理PH值時，表面帶負電荷。若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加快細胞貼壁速度。若微載體帶負電荷，因靜電斥力使細胞難于黏附貼壁，但培養(yǎng)液中溶有或微載體表面吸附著二價陽離子作為媒介時，則帶負電荷的細胞也能貼附。 

4、細胞在微載體表面的生長 影響細胞在微載體表面生長的因素很多，主要有三個方面。

在細胞方面，如細胞群體、狀態(tài)和類型。

在微載體方面，如微載體表面狀態(tài)、吸附的大分子和離子；微載體表面光滑時細胞擴展快，表面多孔則擴展慢。

在培養(yǎng)環(huán)境中，如培養(yǎng)基組成、溫度、pH、DC以及代謝廢物等均明顯影響細胞在微載體上的生長。如果所處條件*，則細胞生長快；反之生長速度慢。

5、微載體培養(yǎng)操作要點

培養(yǎng)初期：保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的PH與溫度水平，接種細胞（對數(shù)生長期，而非穩(wěn)定期）至終體積1/3的培養(yǎng)液中，以增加細胞與微載體接觸的機會。不同的微載體所用濃度及接種細胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微載體含量，更高的微載體濃度需要控制環(huán)境或經(jīng)常換液。

貼壁階段（3-8d）后，緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，并且增加攪拌速度保證*均質(zhì)混合。

培養(yǎng)維持期：進行細胞計數(shù)（胞核計數(shù)）、葡萄糖測定及細胞形態(tài)鏡檢。隨意細胞增殖，微球變得越來越重，需增加攪拌速率。經(jīng)過3d左右，培養(yǎng)液開始呈酸性，需換液：停止攪拌，讓微珠沉淀5min，棄掉適宜體積的培養(yǎng)液，緩慢加入新鮮培養(yǎng)液（37℃），重新開始攪拌。

收獲細胞：首先排干培養(yǎng)液，至少用緩沖液漂洗1遍，然后加入相應(yīng)的酶，快速攪拌（75-125r/min）20-30min。然后解離收集細胞及其產(chǎn)品。

微載體培養(yǎng)的放大：可以通過增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進行放大。使用異倍體或原代細胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗、干擾素，已被放大至4000L以上。 四、微載體大規(guī)模細胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng) 此技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)，細胞擴增的效率受到諸多因素的影響和限制，其中主要的限制性因素包括：細胞對剪切力的敏感性、氧的傳遞以及傳代和擴大培養(yǎng)等。而研制的各種類型生物反應(yīng)器系統(tǒng)則可針對上述限制性因素，為微載體細胞培養(yǎng)與擴增提供低剪切力、高氧傳遞效率、易于細胞傳代等適宜的外部環(huán)境。已較多使用的微載體培養(yǎng)系統(tǒng)生物反應(yīng)器，可以實行計算機控制操作，培養(yǎng)攪拌速度及懸浮均勻程度、溫度變化、PH穩(wěn)定及溶氧供應(yīng)（O2、N2、CO2、空氣四種純化氣體按比例調(diào)節(jié)）、罐壓、培養(yǎng)體積和通氣量等參數(shù)全部由電腦自動控制。因此，應(yīng)用生物反應(yīng)器系統(tǒng)進行微載體細胞大規(guī)模擴增具有明顯優(yōu)勢，目前國外相繼研制了數(shù)種適合進行微載體大規(guī)模細胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，如攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)、旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器系統(tǒng)以及灌注式生物反應(yīng)器系統(tǒng)等。

1、攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng) 攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)在微載體細胞大規(guī)模擴增研究領(lǐng)域已有較長的研究歷史，但因該細胞培養(yǎng)系統(tǒng)容易產(chǎn)生過大的剪切力，從而限制了其應(yīng)用范圍。盡管如此，由于該系統(tǒng)具有簡單、實用及價格低廉等特點，國內(nèi)外仍有不少應(yīng)用該系統(tǒng)成功進行細胞大規(guī)模擴增的研究報道。例如，Werner A（2000年）成功地在該系統(tǒng)內(nèi)進行了肝細胞大規(guī)模擴增的研究。

2、灌注式生物反應(yīng)器系統(tǒng) 灌流培養(yǎng)是目前研究熱點之一。它的特點是不斷地加入新鮮培養(yǎng)基以及不斷地抽走含細胞代謝廢物的消耗培養(yǎng)基，使細胞得以在一個相對穩(wěn)定的生長環(huán)境內(nèi)增殖，即省時省力，又減少了細胞發(fā)生污染的機會，且可以提高細胞密度10倍以上。

3、旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器 近年來，旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器系統(tǒng)（RCCS）已經(jīng)成為應(yīng)用微載體技術(shù)進行細胞大規(guī)模擴增的一種較常用細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)是基于美國航空*為模擬空間微重力效應(yīng)而設(shè)計的一種生物反應(yīng)器。RCCS既可以用于微載體大規(guī)模細胞培養(yǎng)，又能在其內(nèi)培育細胞與支架形成的三維空間復(fù)合體。至今，近百種組織細胞均在該系統(tǒng)內(nèi)成功進行了大規(guī)模擴增。

五、微載體培養(yǎng)優(yōu)點

表面積/體積（S/V）大，因此單位體積培養(yǎng)液的細胞產(chǎn)率高；

把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點；

可用簡單的顯微鏡觀察細胞在微珠表面的生長情況；

簡化了細胞生長各種環(huán)境因素的檢測和控制，重現(xiàn)性好；

培養(yǎng)基利用率較高；

放大容易；

細胞收獲過程不復(fù)雜；

勞動強度小；

培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間小。