HPLC分析是系統(tǒng)的工作，每個環(huán)節(jié)都很重要；看似簡單的環(huán)節(jié)，反而容易疏忽，引起整個實驗的結果偏差，因此養(yǎng)成良好的習慣是很重要的。色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟，液相色譜柱的正確安裝與使用，是色譜工作的關鍵；也是獲得正確可靠的實驗數(shù)據(jù)的必經(jīng)之路。
一·液相色譜柱的安裝
1 液相色譜柱的結構：
a．空柱由柱接頭柱管及濾片組裝而成
柱接頭采用低死體積結構，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為7/16英才外螺紋，另一端是3/16英才的內(nèi)螺紋（國內(nèi)外已規(guī)范化）。7/16英才外螺紋與1/4英寸柱管（￠
在兩端柱接頭內(nèi)，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片（或濾網(wǎng)），用于封堵柱填料不被流動相沖出柱外流失。空柱各組件均為316#不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用。但含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕。
b． 柱填料：
液相色譜柱的分離作用是在填料和流動相之間進行的，柱子的分類是根據(jù)填料類型而定。
正相柱：多以硅膠為填料。根據(jù)外型可分為無定型和球型兩種，其顆粒直徑在3-10um的范圍內(nèi)。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN，—NH2等官能團即所謂的鍵合相硅膠。
反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團（ODS）的非極性填料。也有無定型和球型之分。常用的其他反相填料還有鍵合C8，C4，C2，苯基等，其顆粒直徑在3-10um之間。
2 色譜柱的安裝
a． 拆開柱包裝盒，確認色譜柱的類型，尺寸，出廠日期以及柱內(nèi)儲存的溶劑。
b． 擰下柱兩端的密封堵頭放回包裝盒備用。
c． 按柱管上標示的流動相流向，將色譜柱的入口端通過連接管與進樣閥出口連接（如條件允許，建議在柱前使用保護柱）；柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為
二·液相色譜柱的使用：
色譜柱在使用前，進行的柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行（出廠測試所使用的條件是*條件），只要這樣測試的結果才有可比性。
1 樣品的前處理：
a． 使用流動相溶解樣品。
b． 使用預處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。
c． 使用0.45um的過濾膜除去微粒雜質(zhì)。
2 流動相的配置：
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質(zhì)量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：
a． 流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉淀在柱中（或長時間保留在柱中）。
b． 流動相具有一定的惰性，與樣品不產(chǎn)生化學反應（特殊情況除外）。
c． 流動相的黏度要盡量的小，以便在使用較長的分析柱時能得到好的分離效果；同時降低柱壓降，延長液壓泵的使用壽命（可運行提高溫度的方法降低流動相的黏度）。
d． 流動相的化學性質(zhì)要與使用的檢測器相適應。如用UV檢測器，使用對紫外吸收較低的溶劑配制。
e． 流動相的沸點不要太低，負責容易產(chǎn)生氣泡，導致實驗無法進行。
f． 在流動相配置好后，一定進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利于檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。
3 流動相流速的選擇：
因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求*柱效，使用*流速。對內(nèi)徑為
當選用*流速時，分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間（如反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量）。
注意：
1）.由于甲醇的廉價，對于反相柱推薦使用甲醇體系（必須使用乙腈的除外）。
2）.對于正相柱推薦使用沸程為30
3）.含水流動相在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。加入*，防止細菌的生長。
4）.流動相要求使用0.45um濾膜過濾，除去微粒雜質(zhì)。
5）.使用HPLC級溶劑配置流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。
4 柱性能的測試：
——啟動液相色譜儀：a. 流動相流速設定為1ml/min。
b．UV檢測器波長設定為254nm。
——使用出廠測試時使用的流動相組成及測試樣品。
——記錄并計算測試結果。
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