一、實(shí)驗(yàn)原理
蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，當(dāng)Ph>PI時(shí)帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)作用下向正極移動(dòng)；當(dāng)PH<PI時(shí)帶正電荷，在電場(chǎng)作用下向負(fù)極移動(dòng)；當(dāng)pH＝PI時(shí)凈電荷為零，在電場(chǎng)作用下既不向正極也不向負(fù)極移動(dòng)，此時(shí)Ph就是該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。
各種PH蛋白質(zhì)的PI不同，利用各種蛋白質(zhì)PI不同，以聚丙烯酰胺凝膠為電泳支持物，并在其中加入兩性電解質(zhì)載體，兩性電解質(zhì)載體在電場(chǎng)作用下，按各自PI形成從陽極到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的PH梯度。
在電場(chǎng)作用下，蛋白質(zhì)在此PH梯度凝膠中泳動(dòng)，當(dāng)遷移到PH值等于PI處時(shí)，就不再泳動(dòng)，而被濃縮成狹窄的區(qū)帶，這種分離蛋白質(zhì)的方法稱為聚丙烯酰胺等電聚焦電泳。
聚丙烯酰胺等電聚焦電泳操作簡(jiǎn)單，電泳時(shí)間短，分辨率高。其應(yīng)用范圍廣，可用于分離蛋白質(zhì)及測(cè)定PI，也可用于臨床鑒別診斷、農(nóng)業(yè)、食品研究及動(dòng)物分類等各種領(lǐng)域。隨著其他技術(shù)的不斷改進(jìn)，等電聚焦電泳也不斷充實(shí)完善，從柱電泳發(fā)展到垂直板，又繼而發(fā)展到超薄型水平板電泳等，還可與其他技術(shù)或SDS-PAGE結(jié)合，進(jìn)一步提高靈敏度與分辨率。
二、實(shí)驗(yàn)用品
（一）器材
（1）垂直管電泳槽和玻管。
（2）恒壓恒流電泳儀。
（3）酸度計(jì)
（二）試劑
（1）凝膠貯液：丙烯酰胺30g,甲叉雙丙烯酰胺0.8g,加重蒸水使其溶解后定容至100ml，置棕色試劑瓶中，4℃貯存。
（2）10% TEMED:取10mlTEMED,加重蒸水至100ml,置棕色瓶?jī)?nèi)，4℃貯存。
（3）5%過硫酸胺：稱AP1.0g,加重蒸水至10ml，當(dāng)天配制。
（4）電極緩沖液。
5%磷酸溶液：量取58.8ml85%磷酸，定容至1000ml。
2%NaOH溶液：稱20gNaOH，溶于蒸餾水并定容至1000ml。
（5）兩性電解質(zhì)載體PH3~10。
（6）染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)R-250 50mg，溶于10ml冰乙酸，用重蒸水定容至100ml。
（7）脫色液：10%冰醋酸。
（8）40%蔗糖溶液：稱取40g蔗糖溶于少量蒸餾水中，定容至100ml.
（三）材料
稱取牛血清白蛋白7mg及牛胰核糖核酸酶5mg，共溶于1ml蒸餾水中，置冰箱備用。
三、實(shí)驗(yàn)程序
（一）操作方法
1.凝膠柱的制備
預(yù)先準(zhǔn)備潔凈的玻管兩根，玻璃管的一端插在青霉素或疫苗小瓶的橡皮帽中，使其垂直站立在桌面上或管架中。
將配好的凝膠溶液用細(xì)長(zhǎng)頭滴管加到預(yù)先準(zhǔn)備好的玻管中，至離上端1cm處，再用注射器緩緩加水3~5mm高，靜止聚合30min,待凝膠與水層之間出現(xiàn)折射率不同的界面時(shí)，說明凝膠聚合，再放置0.5h，待聚合*。
2. 電泳
用手指壓迫橡皮帽使其變形，讓空氣進(jìn)入，小心地?fù)艹霾９堋５钩瞿z上層水 ，用濾紙吸干，并用蒸餾水洗去蔗糖溶液，把管固定到電泳槽上槽的洞中，安裝時(shí)要保證凝膠管垂直且橡膠塞孔密封不漏?？梢栽诓壑邢燃尤?%磷酸緩沖液，檢驗(yàn)是否漏液。再在下槽中裝入2%NaOH溶液，把上槽放在下槽上，避免管下有氣泡。上槽接電泳儀的正極，下槽接負(fù)極，先調(diào)出電壓至100V，待電壓穩(wěn)定后再升到300V，電泳2h以上至電流降為0，將電壓調(diào)至0，關(guān)閉電源。
3、剝膠
電泳結(jié)束后，取下冷凝管，用蒸餾水充分洗凈兩端電極液，在凝膠條的正插一銅絲為標(biāo)記。用灌滿水的注射器長(zhǎng)針頭插入凝膠與玻管管壁之間，邊壓水邊慢慢轉(zhuǎn)運(yùn)玻管，推針前進(jìn)，同時(shí)注入水靠水流壓力和潤(rùn)滑力將玻璃管內(nèi)壁與凝膠分開，凝膠條即可流出。
4.固定染色
取其中一條凝膠條放在一塊潔凈的玻板上，用尺量出固定前的凝膠條長(zhǎng)度。放入染色液體中同時(shí)進(jìn)行固定染色1~2h，用蒸餾水漂洗數(shù)次后用脫色液脫色，直至蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，量出蛋白帶距正的距離。
5. pH梯度的制作
取另一條凝膠條放在玻板上，用尺貼近凝膠條，用干凈的刀片，從凝膠的正開始，每隔0.5cm切下一段，依次放入已編好號(hào)并裝有1ml蒸餾水的試管中，浸泡過液。次日用酸度計(jì)分別測(cè)定每管浸提液的pH值。以凝膠長(zhǎng)度為橫坐標(biāo)，pH值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)pH梯度曲線。
6. 蛋白質(zhì)樣品等電點(diǎn)的計(jì)算
用下式求出蛋白質(zhì)聚焦部位距凝膠條正的實(shí)際長(zhǎng)度為：
固定后的蛋白區(qū)帶中心距凝膠條正的距離×（固定染色前凝膠條長(zhǎng)度/固定染色凝膠條長(zhǎng)度 ）
計(jì)算出蛋白質(zhì)聚焦部位距凝膠條正的實(shí)際長(zhǎng)度后，直接從PH梯度曲線上求出該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。
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