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一、實(shí)驗(yàn)原理

聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑在加速劑過(guò)硫酸銨或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳。

聚丙烯酰胺凝膠具有下列特性：

1. 在一定濃度時(shí)，凝膠透明，有彈性，機(jī)械性能好；

2. 化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，在很多溶劑中不溶；

3. 對(duì)PH和溫度變化較穩(wěn)定；

4. 幾乎無(wú)吸附和電滲作用，只要Acr純度高，操作條件一致，則樣品分離重復(fù)性好；

5. 樣品不易擴(kuò)散且用量少；

6. 凝膠孔徑可調(diào)節(jié)，根據(jù)被分離物的相對(duì)分子質(zhì)量選擇合適的濃度，通過(guò)改變單體及交聯(lián)劑的濃度調(diào)節(jié)凝膠的孔徑；

7. 分辨率高。

    

血清蛋白在紙或醋酸纖維薄膜電泳中，只能分離出5~6條區(qū)帶，而聚丙烯酰胺電泳卻可分離出數(shù)十條區(qū)帶，因而，目前PAGE已廣泛用于科研、農(nóng)、醫(yī)及臨床診斷的分析、制備，如蛋白質(zhì)、酶、核酸、血清蛋白、脂蛋白的分離及病毒、細(xì)菌提取液的分離等。

二、實(shí)驗(yàn)用品

 （一）器材

（1）夾心式垂直板電泳槽和凝膠模。

（2）直流穩(wěn)壓電源。

（3）水泵或油泵，真空干燥器。

（4）移液管。

（二）試劑  

（1）凝膠貯液：丙烯酰胺30g,甲叉雙丙烯酰胺0.8g,加重蒸水使其溶解后定容至100ml，置棕色試劑瓶中，4℃貯存，一般可保存1個(gè)月左右。

（2）分離膠緩沖液：取1mol/L 鹽酸42ml，Tris36.6g,加重蒸水至80ml使其溶解，調(diào)PH8.9，然后用重蒸水定容至100ml,置棕色瓶4℃貯存。

（3）濃縮膠緩沖液：取1mol/L 鹽酸48ml，Tris5.98g加重蒸水至80ml，調(diào)PH6.7，用重蒸水定容至100ml，置棕色瓶?jī)?nèi)，4℃貯存。

（4）10%過(guò)硫酸胺：稱AP1.0g,加重蒸水至10ml，當(dāng)天配制。

（5）10% TEMED:取10mlTEMED,加重蒸水至100ml,置棕色瓶?jī)?nèi)，4℃貯存。

（6）Tris甘氨酸電極緩沖液：稱取Tris6g,甘氨酸28.8g，加蒸餾水至900ml，調(diào)PH8.3后，用重蒸水定容至1000ml，置試劑瓶中，4℃貯存，臨用前稀釋10倍。

（7）樣品稀釋液：濃縮膠緩沖液25ml+蔗糖10g+0.05%溴酚藍(lán)5ml，用重蒸水定容至100ml，置試劑瓶中，4℃貯存。

（8）染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)R-250 50mg，溶于10ml冰乙酸，用重蒸水定容至100ml。

（9）脫色液：10%冰醋酸。

（10）保存液：甘油10ml，冰乙酸7ml,加水至100ml.

（三）材料

      新鮮血清（無(wú)溶血現(xiàn)象）。

三、實(shí)驗(yàn)程序

（一）操作方法

1.安裝夾心式垂直板電泳槽

按說(shuō)明書即可

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2.配膠

本實(shí)驗(yàn)采用不連續(xù)體系，分離膠濃度7.5%，濃縮膠濃度為3%，交聯(lián)度均為2.7%。

3.制備凝膠板

將混合后的分離溶液，用細(xì)長(zhǎng)頭的滴管加至長(zhǎng)、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，加膠高度距樣品模板梳齒下緣約1cm。用1ml注射器在凝膠表面沿玻璃板邊緣輕輕加一層重蒸水用于隔絕空氣，使膠面平整。

4.加樣

作為分析用的PAGE加樣量?jī)H需幾微克，2-3µl血清電泳后就能分出幾十條蛋白區(qū)帶。取100µl血清用樣品稀釋液稀釋至1ml。用微量進(jìn)樣器取25µl上述混合液，通過(guò)緩沖液，小心地將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部，由于樣品溶解液中含有比重較大的蔗糖或甘油，因此樣品溶解液會(huì)自動(dòng)沉降在凝膠表形成樣品層。待所有凹形樣品槽內(nèi)都加到了樣品，即可開(kāi)始電泳 。

5.電泳

將直流穩(wěn)壓電泳儀的正極與下槽連接，負(fù)極與上槽連接，接通冷卻水，打開(kāi)電泳儀開(kāi)關(guān)，開(kāi)始時(shí)將電流調(diào)至10mA。待樣品進(jìn)入分離膠后，將電流調(diào)至20~30mA。當(dāng)溴酚藍(lán)染料遷移至距離硅膠框下緣1cm時(shí)，將電流調(diào)回到零，關(guān)電源及冷卻水。旋松固定螺絲，取出硅膠框，用不銹鋼鏟輕輕將玻璃板撬開(kāi)移去，在膠板一端切除一角作為標(biāo)記，將膠板移至大培養(yǎng)皿中染色。

6.固定和染色

為防止膠內(nèi)已分離成分的擴(kuò)散，需要進(jìn)行固定，或浸泡在用7%乙酸液或12.5%Trichloroacetic acid配置的染色液中，同時(shí)進(jìn)行固定和染色，本實(shí)驗(yàn)固定和染色同時(shí)進(jìn)行，使染色液沒(méi)過(guò)膠板，染色1~2h，經(jīng)常搖動(dòng)，如水浴加熱，可以縮短染色時(shí)間。

7.脫色

用10%乙酸浸泡漂洗數(shù)次，直到背景藍(lán)色褪去。如用50℃水浴，則可縮短脫色時(shí)間。

8.制備凝膠干板

1mm以上的膠板常用凝膠真空器制備干板。如無(wú)此儀器可將脫色后的膠板浸泡在保存液中3~4h.制干板時(shí)在大培養(yǎng)皿上平放一塊干凈玻璃板，倒少許保存液在玻璃板上，使其均勻涂開(kāi)，取一張預(yù)先用蒸餾水浸透的玻璃紙平鋪在玻璃板上，趕走氣泡，將四邊多余的玻璃紙緊緊貼于玻璃板的背面。平放于桌上自然干燥1-2d，*干后除去玻璃板，即可得到平整、透明的干膠板，此干板可長(zhǎng)期保存，便于定量掃描。

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