中藥配方顆粒統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)主要包括兩大塊色譜相關(guān)的內(nèi)容： 首先是【特征圖譜】，配方顆粒作為供試品溶液，其特征 圖譜應(yīng)與對照藥材或者對照品參照物溶液色譜圖具有一定 的相關(guān)性，相關(guān)指標(biāo)有：特征峰的個數(shù)、特征峰的保留時間、 特征峰與參照峰的相對保留時間及相對峰面積，甚至有個 別品種還需要進(jìn)行指紋圖譜相似度評價。此外，紫外吸收 特征成分常用 UV 法進(jìn)行檢測，偶見多波長切換的方法， 而無紫外吸收的成分（如：麩炒薏苡仁中的甘油三油酸酯） 使用蒸發(fā)光散射檢測器進(jìn)行測定，往往需要高濃度的對照 品或者供試品溶液（如：1.0mg/ml的薏苡仁油對照品溶液）， 如何選擇合適的通用型檢測器實(shí)現(xiàn)高靈敏度的檢測，應(yīng)該 引起中藥研究者的思考；其次是【含量測定】，含量測定 的色譜方法與特征圖譜的色譜方法可能相同，也可能稍有 簡化，定量指標(biāo)也從 1 個到多個不等，其選取不僅與含量 多少有關(guān)，可能更多的考量在于該指標(biāo)的生物活性是否是 該產(chǎn)品非常重要的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，這一點(diǎn)與中藥研究熱點(diǎn) 應(yīng)不謀而合。
成分復(fù)雜，水溶性成分眾多，提取溶媒多與流動相存在極 性差異等，對于液相色譜方法開發(fā)具有一定挑戰(zhàn)，同時對 于建立的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，如何轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室用于實(shí)際工作，復(fù) 現(xiàn)中需要關(guān)注的實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)，賽默飛液相應(yīng)用團(tuán)隊(duì)整理如下， 以助力客戶在應(yīng)用中順利完成
1. 色譜柱的選擇 基于應(yīng)用團(tuán)隊(duì)對中藥配方顆粒近 100 種的復(fù)現(xiàn)結(jié)果，考慮 到色譜柱的通用性和用戶使用的方便程度，特做如下推薦， 在研發(fā)、質(zhì)控過程中可以考慮選用
2. UHPLC 方法開發(fā) 中藥配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)研發(fā)的單位可以將已有 HPLC 方法利用 變色龍軟件中自帶的“Speed up"功能轉(zhuǎn)換成為 UHPLC 方法，實(shí)現(xiàn)超快速液相方法的轉(zhuǎn)換，該功能轉(zhuǎn)換的結(jié)果 符合 2020 版《中國藥典》四部 0512 通則的相關(guān)規(guī)定， 請大家放心使用，亦可使用賽默飛網(wǎng)頁版方法轉(zhuǎn)換工具
3. 電霧式檢測器的使用 電霧式檢測器（CAD）作為一款通用型檢測器，參數(shù)設(shè)置 少，操作簡單，維護(hù)較易。如有示差檢測器或者蒸發(fā)光散 射檢測器的色譜方法，可以直接轉(zhuǎn)移至 CAD 檢測器進(jìn)行 復(fù)現(xiàn)嘗試。需要注意的是：①該檢測器同其他通用型檢測 器，流動相體系不可使用不揮發(fā)性酸或者鹽；②該檢測器 靈敏度高，原方法中高濃度樣品建議稀釋 10-50 倍后進(jìn)樣， 避免檢測器過載；③流動相條件允許的情況下，該檢測器 可以直接與紫外檢測器串聯(lián)使用，色譜信息可以互相補(bǔ)充， 互相提示，對于反映中藥產(chǎn)品真實(shí)質(zhì)量很有幫助?？捎糜冢?麩炒薏苡仁配方顆粒、地膚子配方顆粒、黃芪配方顆粒等。
4. 梯度洗脫平衡色譜柱 梯度洗脫目前常用于中藥復(fù)雜體系的分離分析，尤其在超 快速液相方法中，短短幾分鐘內(nèi)，梯度變換幅度很大，且 方法后期并沒有注明有恢復(fù)初始流動相比例的階段，就很 容易誤導(dǎo)個別用戶連續(xù)進(jìn)樣，使得色譜柱在進(jìn)樣下一針的 時候，其內(nèi)部有機(jī)相比例還未平衡，導(dǎo)致色譜峰出峰錯亂、 堆疊、相對保留時間不符合規(guī)定值等異常問題，建議客戶 在變色龍軟件編輯方法時注意在原方法前后增設(shè)約 10 分 鐘（平衡至少 5~10 個柱體積），變色龍軟件支持預(yù)平衡 時間的設(shè)置，即預(yù)平衡后自動開始進(jìn)樣分析，該法不會變 動原色譜方法
5. 強(qiáng)溶劑效應(yīng) 比如，中藥配方顆粒參照物 ( 對照品 / 對照藥材 ) 溶液的 制備，多采用一定比例的甲醇 - 水或乙醇 - 水作為提取溶 劑，而色譜方法里設(shè)置的流動相起始梯度可能為高比例水相，在色譜柱分離過程中，由于提取溶劑的洗脫強(qiáng)度高于 瞬時流動相的洗脫強(qiáng)度，就容易產(chǎn)生峰拖尾、峰裂分等峰 異常現(xiàn)象，甚至可能影響合理積分。建議客戶可以采用以 下實(shí)驗(yàn)小技巧來避免強(qiáng)溶劑效應(yīng)的產(chǎn)生：①可以減小進(jìn)樣 體積，如原 10μl 改為 5μl；②采購賽默飛液相配件（Strong Solvent Loop，PN：6036.2200）裝在自動進(jìn)樣器與色譜 柱之間；③采用用戶自定義進(jìn)樣程序（UDP）可自定義 編程在線稀釋等功能，實(shí)例：赤芍配方顆粒（詳情請參見 Application Note《全新高效液相色譜系統(tǒng) Vanquish Core 并聯(lián)分析赤芍配方顆粒特征圖譜與含量測定》）；④在自 動進(jìn)樣器與色譜柱間使用一段較長的 viper 管路等。
6. 梯度延遲體積差異 因統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)起草單位使用儀器未知，在方法復(fù)現(xiàn)過程中可 能會由于儀器間延遲體積的差異導(dǎo)致色譜圖出現(xiàn)整體提前 或者整體靠后的現(xiàn)象，建議：①客戶在選配儀器時可以訂 購不同體積的靜態(tài)混合器測試使用，在復(fù)雜流動相體系的 方法開發(fā)中可以適當(dāng)調(diào)整混合器的體積，不僅可以滿足優(yōu) 異的混合精度，還能夠復(fù)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)譜圖，最常用到的靜態(tài)混 合器體積有：150μl 或者 350μl；②另外，Vanquish Core 液相色譜系統(tǒng)自帶可調(diào)延遲體積（0-230μl），加配方法轉(zhuǎn) 移套件，最大可增至 430μl，可以滿足客戶在不同儀器間 方法轉(zhuǎn)移的需求，可向應(yīng)用團(tuán)隊(duì)索取最新相關(guān)應(yīng)用技術(shù)報 告。
7. 含量測定方法建議 在現(xiàn)有中藥配方顆粒國家 / 省級標(biāo)準(zhǔn)中，含量測定的方法 多采用等度洗脫的方法，然而并未注明全程洗脫時間，可 能會出現(xiàn)目標(biāo)峰出峰較早，但其他非重點(diǎn)關(guān)注成分峰仍在 色譜圖中不斷洗脫出來，建議客戶在此類情況中不要急于 結(jié)束洗脫，為了避免上一針樣品中殘留成分的干擾，樣品 采集時間需大于主成分保留時間 6 倍以上，確保上一針樣 品成分全部洗脫后，方可進(jìn)行下一針樣品的分析。
8. 其他：特征峰丟失 該問題的出現(xiàn)往往與前處理是否完整、提取溶劑是否合適、 色譜柱保留等問題有關(guān)，可以具體問題具體分析再排查
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